v^:« REFERENCE HAMDBOOK OF THE MEDICAL SCIErJCES revi8ed edition Dr. Albert H. Bück, Editor No. 48, West 40th Street New York William Wood and Company, Publishers Einfülirung in das Studium der Bakteriologie mit besonderer Berücksichtigung der mikroskopischen Technik. Für Aerzte und Studirende bearbeitet von Dr. med. Carl Günther, Privatdocent an der Universität, Custos des Hygiene - Museums zu Berlin. Vierte, vermehrte und verToesserte Auflage. Mit 72 iiacli eigenen Präparaten vom Verfasser hergestellten Photogrammen. o®c=» LEIPZIG. Verlag- von Georg Thieme. 1895. Alle Eechte vorbehalten. 7W Druck von Fischer & Wittig in Leipzig. Vorwort. Mit der Herausgabe der vorliegenden vierten Auflage seines Buches verbindet der Verfasser — wie es auch bei den früheren Auf- lagen*) der Fall war — die Absicht, dem Mediciner, und zwar dem Studirenden ebenso wie dem Arzte, eine kurzgefasste, das Wesentliche vollständig bringende Einführung in das praktische Studium der Bak- terienwissenschaft zu geben; der Wissenschaft, mit welcher fast jeder einzelne Zweig der Medicin mehr oder weniger nahe Berührungspunkte besitzt, und über deren Bedeutung für die Medicin heute wohl nicht mehr zu streiten sein dürfte. Wie in den früheren Auflagen, so hat auch in der jetzigen die mikroskopische Technik ganz besondere Berücksichtigung ge- funden; lehrt doch die Erfahrung, wie viel Mühe dem Anfänger speciell der Gebrauch des Mikroskopes, und zwar gerade die elemen- tare, manuelle Technik, macht. Die neue Auflage ist gegen die vorige nicht unwesentlich ver- ändert. Der Text ist sorgfältig revidirt worden; eine Reihe von Ab- schnitten sind von Grund aus umgearbeitet, andere neu eingefügt worden ; fast auf jeder Seite des Textes finden sich Ergänzungen und Verbesserungen. Eine erhebliche Erweiterung des Textes hat sich dabei nicht vermeiden lassen. Bei der Revision der photographischen Tafeln hat der Verfasser Veranlassung gefunden, von den 72 Photogrannnen der dritten Auf- lage 14 wegzulassen und durch ebenso viel neue, zweckentsprechendere Aufnahmen zu ersetzen. Berlin, im August 1895. Dr. Carl Günther. *) Die erste Auflage erschien im Juli 1890, die zweite im März 1891, die dritte im August 1893. Inhalts-Uebersicht. Seite Einleitung 1 A. Allgemeines 5 I. Allgemeine Morphologie und Systematik der Bakterien 7 IL Allgemeine Lebensbedingungen der Bakterien. Desinfection. Sterili- sation. Antiseptik. Aseptik 20 IIL Allgemeine Lebensäusserungen der Bakterien 40 IV. Allgemeine Methodik der Bakterienbeobachtung 47 1. Die Ausrüstung des Arbeitstisches 47 2. Beobachtung der Bakterien im lebenden Zustande. Der hängende Tropfen. Wirkungsweise des A b b e 'sehen Beleuchtungsapparates 52 3. Das gefärbte Deckglas -Trockenpräparat. Die Anilinfarben. Das Princip der maximalen Beleuchtung Hl 4. Beobachtung der Bakterien in Schnitten. Allgemeines über Schnitt- behandlung 86 5. Allgemeines über Färbung und Entfärbung. Leicht und schwer färbbare und entfärbbare Objecto 97 6. Die Gram'sche Methode der Kernentfärbung 108 V. Allgemeine Methodik der Bakterienzüchtung 116 1. Einleitendes 116 2. Die Darstellung der wichtigsten bakteriologischen Nährböden. Nährgelatine, Nähragar, Nährbouillon, Blutserum, Kartoffel, Ei, Brotbrei etc 119 3. Die wichtigsten Methoden der Bakteriencultur 139 4. Anhang: Die Methoden der bakteriologischen Luft-, Wasser- und Boden -Untersuchung und ihre wichtigsten Ergebnisse . . . . 171 a. Luftuntersuchung 171 b. Wasseruntersuchung 174 c. Bodenuntersuchung 181 B. Die Bakterien als Krankheitserreger 185 I. Einleitendes 187 n. Die wichtigsten pathogenen Bakterienarten im Speciellen 226 1. Der Milzbrandbacillus 226 2. Der Bacillus des malignen Oedems 237 VI Inhalts -Uebersicht. Seite 3. Der TetanusbaciUus 240 4. Der Eauschbrandbacillus 246 5. Der Tuberkelbacillus (Bacillus der Säugethiertuberculose) . . . 249 6. Der Bacillus der Hiihnertuberculose (Geflügeltuberculose) . . . 272 7. Bakterien bei „Pseudotuberculose" 276 .8. Der LeprabaciUus 278 9. Bacillen bei Syphilis. SmegmabaciUen 280 10. Der Eotzbacillus 281 11. Der Typhusbacillus 284 12. Der Bacillus der Mäusesepticaemie und der Bacillus des Schweine- rotlilaufs 294 13. Der Diphtheriebacillus 297 14. Die Bacillen der Septicaemia haemorrhagica 308 Hühnercholera 309 Kaninchensepticaemie 310 Deutsche Schweineseuche, amerikanische Schweineseuche . . . 311 Einder- und Wildseuche 312 BüfFelseuche, Frettchenseuche, Mäusetyphus 313 15. Der Bacillus des grünen oder blauen Eiters 315 16. Der KommabaciUus der Cholera asiatica (Vibrio cbolerae asiaticae) 317 17. Der Vibrio Metschnikoff 348 18. Wasservibrionen 352 Spirillum marinum, Massaua-Vibrio 352 Eenon's Vibrio, Vibrio Danubicus, Vibrio aquatiHs .... 353 Vibrionen von Kiessling, Loeffler, Weibel, Bujwid, Fokker, E. Koch 354 Vibrio Berolinensis 355 Vibrio von Bonhoff, von Dunbar 356 Vibrionen von Blachstein, Sanarelli, Wernicke . . . 357 Vibrionen von E. Pfeiffer, Kutscher 358 19. Vibrionen anderer Herstammung 358 Vibrio von Finkler und Prior (Vibrio Proteus) 359 Deneke's Vibrio 360 Vibrionen von Miller, Bleisch, B. Fischer (Vibrio heiko- genes), Vogler 362 Vibrio von Zörkendörfer, Vibrio Eomanus, Vibrio terrigenus, Vibrio von Wolf, Lissaboner Vibrio 363 Vibrionen von Brix, von Kutscher 364 20. Das Bacterium coli commune 364 21. Der Gonorrhoecoccus 369 22. Der Streptococcus des Erysipels 373 23. Die Eitermikrococcen (pyogene Coccen) 375 a. Der Staphylococcus pyogenes aureus 378 b. Der Staphylococcus pyogenes albus 380 c. Der Streptococcus pyogenes 381 24. Die Bakterien der Pneumonie 385 a. Der Diplococcus pneumoniae 387 b. Der Bacillus pneumoniae 390 25. Der Bacillus des Ehinoscleroms 391 Inhalts -Uebersicht. YII Seite 26. Der R. Pfeiffer 'sehe Kapselbacillus 392 27. Der Influenzabacilhis 393 28. Der Bacillus der Bubonen-Pest 395 29. Der Micrococcus tetragenus 397 30. Die Spirochaete des Recurrensfiebers 398 31. Der Actinorayces 399 Anhang 403 Die pathogenen Schimmelpilze 403 Die pathogenen Protozoen 406 Saprophytische (nicht pathogene) Bakterienarten 411 1. Kartoffelbacillen 413 a. Bacillus mesentericus vulgatus 413 b. Bacillus mesentericus fuscus 414 c. Bacillus liodermos 414 d. Bacillus raultipediculus 415 e. Bacillus mesentericus ruber 415 2. Der Heubacillus 415 3. Der Wurzelbacillus 417 4. Bacillus Megaterium 418 5. Die Proteusarten Hauser's 419 a. Proteus vulgaris 419 b. Proteus mirabilis 420 c. Proteus Zenkeri 420 6. Bacterium termo 420 7. Der Hueppe'sche Milchsäurebacillus 421 8. Die Bakterien der Buttersäuregährung 423 a. Der Bacillus butyricus Prazmowsky 423 b. Der Bacillus butjTicus Hueppe 424 c. Der Bacillus butyricus Botkin 424 9. Bakterien der Essiggährung 425 10. Die Milchkothbakterien Esche rieh 's 425 a. Das Bacterium lactis aerogenes 425 b. Das Bacterium coli commune 425 11. Die Bakterien der ammoniakalischen HarnstofFgährung 425 a. Der Micrococcus ureae Leube 426 b. Der Micrococcus ureae liquefaciens Flügge 426 c. Der Bacillus ureae Leube 426 12. Bakterien der Mundhöhle 426 a. Leptothrix buccahs innominata 426 b. Bacillus buccalis maximus 426 c. Leptothrix buccahs maxima 427 d. Jodococcus vaginatus 427 e. Spirillum sputigenum 427 f. Spirochaete dentium 427 Leptothrix gigantea ; Jodococcus magnus; Jodococcus parvus . 427 13. Der Bacillus der blauen Milch 427 14. Bacillus violaceus 429 15. Bacillus ruber Indiens 429 Vni Inhalts -üebersicht. Seite 16. Bacillus prodigiosus 430 17. Microcoecus agilis 430 18. Spirillum rubrum Esmarch 431 19. Chromogene Sarcinen 432 20. Fluorescirende Bakterienarten aus Wasser 432 21. Bacillus fluorescens liquefaciens 433 22. Phospborescirende Bakterien 433 a. Bacillus pbospborescens 433 b. Bacterium pbospborescens 434 c. Der einbeimiscbe LeucbtbaciUus ....434 23. Spirülum concentricum Kitasato 434 24. Einige andere sapropbytiscbe Bakterienarten 435 a. Bacillus tremulus Kocb 435 b. Spirillum Undula 435 c. Spirocbaete plicatUis 435 d. Bacterium Lineola 436 e. Bacillus Ulna 436 f. Vibrio Eugula 436 g. Vibrio serpens 436 h. Spirillum tenue 436 i. Spirillum volutans 436 An bang 437 Schimmelpilze . . 437 Hefen 437 Register 439 Vorbemerkung zu den Tafeln 459 Druckfehlerberichtigung 461 Einleitung. Unter der Bezeiclmimg „Bakterien" fasst man eine Gruppe kleinster einzelliger organischer Wesen zusammen, welche, ihrer grossen Mehrzahl nach, in physiologischer Beziehung den Pilzen nahe stehen und sich durch Theilung des Einzelindinduums in zwei Individuen, durch Spaltung, vermehren. Man spricht deshalb auch von Spalt- pilzen, Schizomyceten, und gebraucht diese Ausdrücke sjiion}^!! mit dem Ausdrucke Bakterien. Auch die Bezeichnungen Mikro- organismen, Mikrobien, sind, im engeren Sinne verstanden, fiir diese Gebilde vielfach in Gebrauch. Die ausserordentliche Verbreitung derselben in der Natur hat die Aufmerksamkeit der Forscher schon frühzeitig auf sie gelenkt. Der Erste, welcher die uns geläufigen Bakterienformen gesehen und abgebildet hat, war Leeuwenhoek in Delft (Holland) 1683. Der geniale Beobachter sah diese „Thierchen" mit Hülfe stark vergrössernder einfacher Linsen, die er sich selbst geschliffen hatte, in seinem Zahnbelage und in anderen Flüssigkeiten. Seit jener Zeit und dann namentlich seit den dreissiger Jahren unseres Jahrhunderts, nachdem das Mikroskop gewaltige Verbesserungen er- fahren hatte, hat man den kleinsten Lebewesen die Aufmerksamkeit zugewendet.^) Aber erst die letzten Jahrzehnte sind es gewesen, welche ein fruchtbringendes Studium dieser Gebilde in grösserer Ausdehnung er- möglicht haben; erst seit dieser Zeit können wir von einer bakterio- logischen „Wissenschaft" sprechen. Um das recht zu verstehen, müssen wir uns den jetzigen und den früheren Zustand vergegen- wärtigen. Jeder, nicht bloss der Arzt, sondern jeder Laie, spricht jetzt von Tuberkelbacillen , von Milzbrandbacillen. Li diesen Worten liegt ohne Weiteres die Ueberzeugung, dass damit von einander ver- *) Bezüglich der Geschichte der Bakterienlehre verweise ich auf das aus- gezeichnete Werk Fr. Loeffler's: Vorlesungen über die geschichtliche Entwickelung der Lehre von den Bakterien. I. Theil. Bis zum Jahre 1S7S. Leipzig ISST. Günther, Bakteriologie. 4. Auflage. 1 2 Einleitung. schiedene Bacillenarten gemeint seien, dass der Tiiberkelbacilliis seine specüischen Eigenschaften habe, nnd dass diese von den speci- fischen Eigenschaften des Milzbrandbacillus verschieden seien; es liegt darin die üeberzeugung, dass das Geljiet der kleinsten Organismen ebenso aus einzelnen, je durch charakteristische constante Merkmale gekennzeichneten Species zusammengesetzt ist, wie das in allen übrigen Abtheilungen der lebenden Natur der Fall ist. Die Erkennt- niss dieser so einfach, so selbstverständlich erscheinenden Thatsache hat aber erst ernmgen werden müssen. Wenn man daran denkt, dass wenig mehr als drei Jahrzehnte uns von dem Zeitpunkte trennen, wo ernste wissenschaftliche Männer eine Entstehung der Bakterienvege- tationen in unseren Gefässen durch Urzeugung, durch Generatio aequivoca, noch ftir möghch hielten, wo es erst bewiesen werden musste, dass ohne das Vorhandensein von entwickelungsfähigen Keimen Bakterienvegetationen nie auftreten, wenn wir dies bedenken, so wird es uns nicht Wunder nehmen, dass noch vor zwanzig Jahren von mehreren berühmten Seiten i) auf Grund experimenteller Untersuchungen die Existenz verschiedener Species bei den Bakterien direkt m Abrede gesteift resp. die Abgrenzung derselben in einzelne Species nicht für zwingend erachtet wurde. Dass dieses möghch Avar, erklärt sich aus folgendem: Man hatte zwar optische Hülfsmittel, die Bakterien zu sehen: man kannte die Formen, unter denen sie auftreten, sehr gut; man verstand aber nicht, aus einem Bakteriengemenge das einzelne Individuum, die einzelne Zelle herauszunehmen und für sich, isolirt, in ihrer Weiterentwickelung und in ihrem gesanunten Verhalten zu studiren. Dem genialen Blicke Robert Ivoch"s war es vorbehalten, die Schwierigkeiten in diesem Pimkte zu beseitigen. Durch Einführung einer neuen, überaus einfachen Methodik gelang es Koch, die einzelne Bakterienzelle zu isohren und das Verhalten der isolirten Bakterien- zelle unter den verschiedensten äusseren Bedingungen weiter zu ver- folgen. Hierbei wurde sofort die Erkenntniss gewonnen, dass unter gleichen Bedingungen nicht alle Bakterienzellen sich gleich verhalten, sondern dass es sich bei den Bakterien um eine grosse Reihe von einander verschiedener Arten handelt, deren jede dm-ch ein ihr eigen- thümliches, specifisches Verhalten charalvterisirt ist. Diese Erkenntniss ') cf. Th. Billroth, Untersuchungen über die Vegetationsforraen von Cocco- bacteria septica etc. Berlin 1S74. — C. v. Nägeli, Die niederen Pilze in ihren Beziehungen zu den Infektionskrankheiten und der Gesundheitspflege. München 1877. p. 20. Einleitung. 3 ist der Grundstein, auf dem allein sich eine wissenschaftliche Erforschung des Gebietes aufbauen konnte. Nur die I s o 1 i r u n g der einzelnen Art ermöglichte es, ihre Eigenschaften festzustellen, ihre Lebensbedingungen, ihre Lebensäusserungen kennen zu lernen. Die glänzenden Entdeckungen, welche dieser erste Schritt aus dem Dunkel in das Helle zur unmittelbaren Folge hatte, namentlich die Entdeckungen auf medicinischem Gebiete, haben das allgemeine Interesse der Gebildeten der Bakteriologie zugewandt. Für das erspriessKche Wirken des modernen Arztes aber ist es eine conditio sine qua non geworden, sowohl sich mit den Lebenseigenschaften der Bakterien im Allgemeinen vertraut zu machen, wie auch die speciellen Bakterien- arten, die bei der Entstehung von Krankheiten eine Kolle spielen, des Näheren kennen zu lernen. Denn auf der ersteren Kenntniss beruhen die Avichtigsten Theile unserer modernen Hygiene im Allgemeinen, auf ihr beruhen Desinfection und Antiseptik, beruht die chirurgische Aseptik mit ihren glänzenden Resultaten ; die Kenntniss der speciellen Lebens- eigenschaften der Krankheitserreger aber weist uns allein mit Sicher- heit den Weg, den eine rationelle Prophylaxis gegen die einzelnen Seuchen zu beschreiten hat. Mit diesen Punkten ist jedoch der praktische Nutzen der Bakterio- logie nicht erschöpft. Die Entdeckungen der letzten Jahre Aveisen mit Sicherheit darauf hin, dass die Bakterienwissenschaft berufen ist, auch für die Heilkunde im engeren Sinne, fiir die Therapie, von grösster Bedeutung zu werden. Die folgenden Blätter stellen sich die Aufgabe, den medicinischen Leser in das Gebiet der modernen Bakterienwissenschaft, soweit deren Kenntniss für ihn ein unumgängüches BedürMss ist, einzuführen; dem Bedürfnisse des Arztes entsprechend soll die mikroskopische Technik hierbei besonders berücksichtigt werden. Wir werden uns zunächst mit der allgemeinen Morphologie und S^^stematik der Bakterien, mit der allgemeinen Betrachtung ihrer Lebens- bedingungen und L e b e n s ä u s s e r u n g e n zu beschäftigen haben, irni uns dann der allgemeinen Untersuchungsmethodik zu- zuwenden. Dann werden wir das Gebiet der krankheitserregen- den Bakterien im Allgemeinen und im Anschlüsse daran die wichtigeren einzelnen pathogenen Bakterienarten zu betrachten haben; anhangswTise sollen auch die pathogenen Faden- pilze und die pathogenen Protozoen Erwähnung finden. Endlich Averden wir auch einige der bekannteren nicht pathogenen Arten behandeln. A. Allgemeines. Morphologie, Systematik, Lebensbedingungen und Lebensäusserungen der Bakterien. Beobachtungs- und Züchtungsmethoden. I. Allgemeine Morphologie und Systematik der Bakterien. Hiin natürliches System der Bakterien anfzustellen ist bisher nicht gelungen. Diese Aufgabe bleibt einer späteren. Zeit vorbehalten. Ein natürliches System ordnet die einzelnen Species nach den natür- lichen Verwandtschaften, wie sie sich aus der vergleichenden Betrach- tung sämmtlicher Eigenschaften der einzelnen Arten ergeben ; ein künstliches System greift ein einzelnes in die Augen fallendes Merk- mal heraus und gruppirt danach. Da nun die Bakterienkunde eine noch junge Wissenschaft ist, und da demgemäss die Eigenschaften auch der wichtigsten Bakterienarten bis jetzt nur unvollkommen bekannt sind, so müssen wir uns vor der Hand noch mit einer künstlichen Classificirung begnügen. Ferdinand Cohn griff, als er 1872 sein System^) der Bakterien aufstellte, das Merkmal der Form heraus; nach der Form der Einzelzellen und nach der Form der Verbände, in denen diese Einzelzellen auftreten, theilte er die Bakterien ein. Diese Art der Eintheilung ist auch heute noch die allgemein gebräuchliche. Wir unterscheiden danach drei grosse Gruppen: Kugelbakterien (IVIikrococcen, Coccen), Stäbchen bakterien (Bacillen) und S c h r a u- b e n b a k t e r i e n (Spirillen). Die Kugelbakterien, Mikrococcen, stellen in einem ge- wissen Entwickelungsstadium (d. h. unmittelbar nach vollendeter Theilung der Mutterzelle) kugelrunde Zellen dar; die Stäbchenbakterien, Bacillen, sind Cylinder von kreisförmigem Querschnitt, deren Längs- achse den Querdurchmesser an Ausdehnung übertrifft; die Schrauben- bakterien, Spirillen, sind schraubenartig, korkzieherförmig ge- wundene Gebilde. Xach de Bary") lassen sich die drei Formtypen ^) Beiträge zur Biologie der Pflanzen. Bd. 1. Heft 2. 1S72. p. 1-lü. ^) A. de Bary, Vorlesungen über Bakterien. 2. Aufl. 1877. p. 8. 8 A. Allgemeines. am Tbesten veranschaulichen durch bezw. eme Billardkugel, emen Blei- stift und einen Korkzieher. Auf Taf. I, Fig. 1, ist ein Bakteriengemisch dargestellt, welches Bakterien aus der Mundhöhle zeigt. Man findet hier Angehörige jedes der drei Fornitypen durchemander gemengt. Das Bild ist bei lOOOfacher Yergrösserung hergestellt; bei derselben Vergrösserung sind auch die folgenden Photogramme aufgenommen : die Bilder lassen also eine unmittelbare Grössenvergieichung der dar- gestellten Bakterien zu. Es fällt an diesen Bildern ohne Weiteres auf, dass es lange und kurze, dicke und schmale Bakterien giebt. Im Allgemeinen kann man sagen, dass die Dicke der Bakterienzellen sich nach Zehntausendsteln eines Millimeters bemisst, die Länge nach Tau- sendsteln. Es giebt aber nicht seltene AusnaJmien, in denen die Dicke einer Bakterienzelle ^I^^Q^mm, 1 fx (Mkron), überschreitet.^) Beispiele davon sehen wir z. B. auf Taf. III, Fig. 1 6 ; die Dicke der hier dar- gestellten Bakterienzellen beträgt auf dem Bilde i,6 — 1,7mm, d.h. in dem Präparate selbst 1,6 — 1,7 jll Der Dickendurchmesser der Bakterien bleibt aber stets erheblich zurück hinter demjenigen der Zellen von Sprosspilzen (Hefen) und von Schimmelpilzen (Fadenpilzen), die wir bei bakteriologischen Untersuchungen nicht selten zu Gesicht bekommen. Auf Fig. 5 (Taf. I) sehen wir (in dem rechten unteren Quadranten dieser Figur) Gebilde, die man ihrer Form nach für Bacillen halten könnte. Betrachten mr jedoch die anderen Theile dieser Figur, so finden wir, dass es sich um einen zweigbildenden Organismus, um einen Fadenpilz handelt, der an einzelnen Stellen in kürzere, bacillenartig geformte Theile auseinander gefallen ist. Die Dicke der Zellen beträgt auf dem (1000 fach vergrösserten) Photogramm 2— 5 mm, d. h. in Wirklichkeit 2 — 5 /*. Ein derartiger Dickendurchmesser kommt bei Bakterien nicht vor. Ein anderes Beispiel eines Fadenpilzes zeigt Taf. Xn, Fig. 72. Hier ist der Herpes tonsurans -Pilz bei 240facher Vergrösserung dargestellt. Die Zellen sind im Bilde 1,3 — 1,8 mm, d. h. in Wirklichkeit 5,4—7,5 fi, fhck. Auf Taf. I, Fig. 6, ist ein (in Sprossbildung begriffener) Sprosspilz (Hefepilz) dargestellt, dessen Zellen etwa 6 fi dick sind. Die Dickenverhältnisse der Zellen lassen dieBakterien von den eigentlichen Pilzen jedes- mal mit Leichtigkeit sofort unterscheiden. Die Bakterienzelle setzt sich zusammen aus einem (nach ') Unter dem Mikroskope misst man die Grösse der Bakterien ebenso wie die irgend welcher anderen Objecto bekanntlich so, dass man die in Frage kommenden Ausdehnungen des Bildes vergleicht mit den Bildausdehnungen eines unter denselben Bedingungen mikroskopisch betrachteten Objectes von bekannter Grösse (0 b j e ctm i k r o m e ter). I. Allgemeine Morphologie und Systematik der Bakterien. 9 neueren Untersuclmngen mit hoher Wahrscheinlichkeit als Kern auf- zufassenden) Protoplasmakörper, welcher von einer Membran (Plasmahülle) umschlossen ist. Das Bakterien-Protoplasma färbt sich wie andere protoplasmatische Körper durch Jod gelb bis braun, es lässt sich ebenso wie jene mit Carmin und mit Anilinfarben tingiren. Die Membran, ihrer chemischen Natur nach nicht bei allen Arten gleich^), geht nach aussen hin unmittelbar über in eine schleimige, in Wasser mehr oder weniger quellbare Hülle. Während diese meist eine nur geringe Ausdehnung besitzt und uns nicht be- sonders auffällt, erreicht sie in anderen Fällen eine im Vergleich zu dem Protoplasmakörper sehr erhebliche Ausdehnung. Man spricht dann von Kapsel bakterien (Grioeococcus). Ein derartiges Beispiel zeigt Taf. XII, Fig. 69. Wir sehen hier den Friedländer'schen so-, genannten Bacillus pneumoniae, dessen Protoplasmakörper durch Fuchsin intensiv dunkel tingirt ist, während die Hülle oder Kapsel sich als weniger intensiv gefärbte Masse kenntlich macht. Der Proto- plasmakörper der Bakterien ist bei weitaus den meisten Arten farblos, chlorophj'lllos. Die Bakterien stellen sich in diesem Punkte und den daraus resultirenden physiologischen Eigenschaften den Pilzen nahe. (^Nur bei einzelnen wenigen Bakterienarten sind dem Chlorophyll nahe- stehende Farbstoffe (z. B. das als echtes Chromophyll aufzufassende sogenannte Bacteriopurpurin) nachgewiesen a Hier weichen dem- gemäss auch die physiologischen Eigenschaften von den gewöhnlich zu beobachtenden ab. Auch können sich mehrere derartige Farbstoffe gleichzeitig neben einander vorfinden (Bütschli)-). Handelt es sich hier um Farbstoffe, mit deren Anwesenheit wichtige physiologische Functionen verbunden sind, so werden andererseits von sehr vielen (.,c h r m g e n e n") Bakterienarten Farbstoffe producirt, die wahrschein- lich nur als Stoffwechselproducte aufzufassen sind. Die hierhergehörigen Arten fallen in ihren Culturen ohne Weiteres durch die meist lebhafte Färbung derselben auf. Der I'arbstoff wird in diesen Fällen gewöhn- lich ausserhalb der Bakterienzellen liegend angetroffen; die Zellen selbst sind ungefärbt, f Das Bakterienprotoplasma zeigt bei einer Reihe von Arten Stärke- (oder richtiger Granulöse-) Gehalt: mit wässeriger Jodlösung färbt es sich hier dunkel indigoblau.\ Bei einzelnen ^) Die Membran wird meist aus einer celluloseartigen Substanz gebildet; bei einzelnen Arten jedoch besteht sie — wahrscheinlich — aus einem eiweissartigen Körper, (cf. A. de Bary. Vergleichende Morphologie und Biologie der Pilze etc. Leipzig. 1884. p. 493.) ") lieber den Bau der Bakterien und verwandter Organismen. Leipzig. 1S90. p. 10. 10 A. Allgemeines. Arten finden sich (kiystallinische) stark lichtbrechende Schwefel- körnchen in dem Protoplasma vertheilt (Schwefelhakterien); andere zeigen Eisenoxyd in ihrer Hülle eingelagert (Eisen- hak t e r i e n ). Die Bakterienzelle als Ganzes ist hei manchen Arten ge'\nss ein relativ starres Gebilde ; hei anderen Arten ist dies jedoch sicher nicht der Fall. Es ist mir öfters begegnet, dass ich bewegliche Bacillen, welche in der Flüssigkeit als gerade Stäbe umherschwanunen, sich durch enge Hindernisse hindurchdrängen sah. Hierbei verengerten sich die verschiedenen Stellen des Bakterienleibes der Reihe nach, dem HindeiTiisse entsprechend, und in schlangenartigen Windungen entwand sich die Zelle dem Engpasse, auf der anderen Seite als gerades Stäbchen weiterschwimmend. Bei Zutritt von bestinnnten Flüssigkeiten zu Bakterienzellen be- obachtet man, wie das bei den Zellen höherer Pflanzen längst bekannt ist, einen eigenthümlichen, als „Plasmolyse" bezeichneten Vorgang. Der Protoplasmakörper, welcher vorher der Membran dicht anlag, zieht sich von der Membran zurück und contrahirt sich nach dem Centrum hin. Hier nimmt er je nach der Gestalt und dem Bau der Zelle ver- schiedene Gestalt an. Nur lebende Zellen lassen sich „plasmolysiren". Am besten eignen sich ^/^ bis 10 proc. Kochsalzlösungen. Bringt man die plasmolysirte Zelle in AVasser zurück, so tritt wieder die ursprüng- liche Gestalt ein.^) Die Bakterien vermehren sich (abgesehen von der nur unter besonderen Bedingungen auftretenden sogenannten Sporenbildung) durch Theilung, durch Spaltung der einzelnen Zelle in zwei Zellen. Dies geht so vor sich, dass die Zelle in die Länge wächst, und dass sie sich dabei in der Mitte der Quere nach einschnürt. Ist die Ein- schnürung vollendet, so ist damit die ursprüngliche Zelle in zwei Zellen zerfallen, deren jede ebenso aussieht wie die Mutterzelle vor dem Be- ginne des Theilungsvorganges. Tafel H, Fig. 11, zeigt grosse' Mkro- coccen, die z. Th. in Theilung begriffen sind. Man sieht da ausser rein kugelförmig gestalteten Zellen solche, die in die Länge gezogen und deutlich eingeschnürt sind (Biscuit- oder Semmelform). Aber ausserdem bemerkt man auch vereinzelte, zwar von der Kugelform abweichende, längliche Gebilde, die aber noch keine deutliche Ein- ^) cf. A. Fischer, Ber. d. K. Sachs. Ges. d. Wisseusch. Math.-phys. Classe. 2. März 1891. — Durch 10 proc. Milchsäurelösung lassen sich die plasmolytischen Erscheinungsformen fixiren, so dass che Zellen resp. der Protoplasmakörper nachher in dieser Form gefärbt werden können. — Vergl. auch A. Fischer. Untersuchungen über Bakterien. Jahrb. f. wiss. Botanik. Bd. 27. 1894. I. Allgemeine Morphologie und Systematik der Bakterien. 1 1 schnünmg zeigen. Diese Gebilde stellen das erste Stadium des Thei- limgsvorganges dar ; sie zeigen zugleich , dass ein Miki'ococcus nicht unter allen Umständen rein kugelförmig aussieht. Nur ein bestimmtes Stadium, näniKch das der eben vollendeten Theilung, bringt die Kugel- gestalt rein zum Ausdruck, und an dieses Stadium muss man sich halten, wenn es sich im gegebenen Falle darum handelt, zu entscheiden, ob man eine bestimmte Bakterienart als Mikrococcus , d. h. Kugel- bacterium, oder als Bacillus, d. h. Stäbchenbacterium, bezeichnen soll. Die Figuren 2—4, 7, 8, 10—13 (Taf. I— m) zeigen eine Reihe von Bacillen- und von Mikrococcenformen ; auf jedem Bilde findet man eine Anzahl von Zellen, welche in Theilung begriffen sind. Die Richtung, in welcher die Verlängerung der sich zur Theilung anschickenden Zelle geschieht, entspricht bei den Bacillen und Spirillen der Längsrichtung des Individuums; bei den Mikrococcen entspricht sie in der Regel der Richtung, in welcher die Verlängerung bei dem vorhergehenden Theilungsprocesse erfolgte. Dies letztere gilt jedoch nicht ohne Ausnahme. Es giebt Mki-ococcenarten , bei denen nach erfolgter Theilung der Zelle die beiden Tochtermiki-ococcen sich in einer Richtung theilen, die senkrecht auf der Richtung der ersten Theilung steht; es entstehen dann vier im Quadrat gruppirte Mila'o- coccen. Ein Beispiel hierfür zeigt Taf. XE, Fig. 67. Man bezeichnet solche ^Formen als Merismopedia (d. h. Tafelcoccen) oder als Tetragenus.) Haben wir hier eine Theilung nach zwei Richtungen des Raumes vor uns, so giebt es andererseits Mkrococcenarten, bei denen die Theilung in allen drei Richtungen des Raumes vor sich geht. Es entstehen so packetförmige Zusammenlagerungen von je acht Coccen. Solche Ai'ten bezeichnet man als Sarcina (cf. Taf. III, Fig. 14). Sehen wir von diesen Ausnahmen ab7"so findet bei den Bakterien die Theilung stets in der Richtung statt, in der die vorhergehende Theilung stattfand. Ist die Theilung vollendet, su können die Tuchter- zellen aneinander hängen bleiben und so ketten artige Verbände bilden, die zunächst aus zwei, dann aus vier, acht u. s. w. Individuen bestehen. Taf. I, Fig. 3, zeigt solche Kettenbildung bei einer Art grosser und dicker Bacillen ( „Wurzelbacillen" ) ; Taf. VI, Fig. 33, zeigt dieselbe Erscheinung bei den Mlzbrandbacillen. Auf Taf. in, Fig. 13, sind Mikrococcenketten zu sehen. Mkrococcenarten, welche eine der- artige kettenförmige Anordnung der Incüviduen zeigen, nennt man Streptococcus (öT^sTira = Halskette ) ^). Handelt es sich hier mn ^) Synonym mit „Streptococcus" wird, jedoch selten, das Wort „Torula"' gebraucht. Diese Bedeutung des Wortes Torula ist nicht die gewöhnliche; ge- wöhnlich bezeichnet „Torula" Hefe. 12 -A.. Allgemeines. VerlDände, die gewöhnKch aus einer grösseren Reihe von Einzelzellen zusammengesetzt auftreten, so giebt es andererseits Bakterienarten (be- sonders ]\likrococcen ) , deren Zellen gewöhnlich zu zweien vereinigt, l^aarweise auftreten. Man spricht dann von Diplococcen. Beispiele derart zeigen Taf. XI, Fig. 65, und Taf. XH, Fig. 68. Bleiben Mkro- coccen nach der Theilung nicht aneinander hängen, fallen sie aus einander, so kommen keine Kettenverbände zu Stande, sondern die Einzelzellen lagern sich, wie es der Zufall bringt, nebeneinander ; solche Arten bezeichnet man als Staphylococcen {oracpvXr] = TrsLuhe) nach den unter dem Mikroskop oft weintraubenartig erscheinenden Bildern, die derartig gelagerte Mkrococcen darbieten (cf. Taf. ü, Fig. 1 2). Bei den Bacillenarten spricht man je nach der Grestalt der Zellen resp. nach dem Verhältnisse ihres Längsdurchmessers zum Querdurchmesser von plumpen, von schlanken Bacillen, von Kurz- stäbchen, von Langstäbchen (cf. Taf. I, Fig. 2 und 4; Taf. H, Fig. 7 und 8). Es ist hier zu bemerken, dass von einigen Autoren synon3'm mit dem Begriffe Kurzstäbchen der Begriff „Bacte- riuni'' gebraucht wurde und noch wird. Gegen diesen Gebrauch ist nichts einzuwenden, wenn man sich nur stets dabei denkt, dass das Wort .,Bacterium" hier im engeren Sinne angewendet wird, dass man eine bestimmte Form damit meint, während man unter Bakterien im Allgemeinen die ganze grosse, oben näher definirte Gruppe niederster Pflanzen versteht, die die verschiedensten Coccen-, Bacillen- und Spi- rillenformen umfasst. Es giebt Bacillenarten, deren Einzelindividueu sich nach der Theilung voneinander trennen, andere, deren Glieder nach der Theilung kettenförmig aneinander hängen bleiben. Bezüghch dieser Gruppirungsverhältnisse kommt es nmi häufig sehr auf die äusseren Bedingungen an, unter denen das Wachsthmn erfolgt. Be- trachten wii- beispielsweise den Mlzbrandbacillus. Innerhalb des in- ficii-ten Thierkörpers (cf. Taf. V. Fig. 27—29) treffen wir die Stäbchen entweder einzeln oder zu kleinen Kettenverbänden angeordnet. In der künstlichen Cultur hingegen (cf. Taf. VI, Fig. 31—33, 36; Taf. YH, Fig. 37) finden wir den Mlzbrandbacillus stets zu langen, manchmal gewiss Tausende von Gliedern umfassenden Ketten oder Fäden aus- gewachsen. Derartige Beobachtungen kann man bei vielen Bacillen- arten machen. Es giebt nun aber Bacillenarten, die stets in längeren Fäden verbunden (auch „ S c h e i n f ä d e n " genannt) auftreten. Hierhin gehören z. B. die in der Mundhöhle vegetirenden, als Mj'cothrix, L e p 1 1 h r i X , S t r e p t o t h r i x bezeichneten Bacillenarten (cf. Taf. r\^ Fig. 21). Was die Abtheilung der Spirillen (Beispiele auf Taf. I, Fig. 1; I. Allgemeine MorjAoIogie und Systematik der Bakterien. 13 Taf. m, Fig. 15 und 16; Taf. XII, Fig. 70) angeht, so ist zu be- merken, dass auch die als „Komniabacillen" bezeichneten Gebilde in diese Abtheilung gerechnet werden müssen. Die Komniabacillen (Beispiele auf Taf. X; ferner Taf. HI, Fig. 18) sind gelallmmte Stäb- chen; die Krümmung liegt jedoch nicht in einer Ebene, sondern sie ist thatsächlich ein Bruchtheil einer Schrauben- oder Korkzieher\nndung. Unter gewissen Umständen (in älteren Culturen) bleiben die Komnia- bacillen nach der Theilung aneinander hängen und bilden dann wirk- liche Spirillen. Ein Beispiel sieht man auf Taf. X. Hier zeigt Fig. 55 die gewöhnliche kommaförniige Erscheinungsweise der Cholerabacillen, Fig. 56 zeigt dieselben Organismen zu Spirillen ausgewachsen.^) Für die Kommaorganismen ist auch der Ausdruck „Vibrionen" in Gebrauch. Bezüglich der Anordnung der Bakterienverbände ist im Allgemeinen noch zu bemerken, dass man, besonders in wässerigen Flüssigkeiten, in welchen Bakterien wuchern, die letzteren häufig in voluminösen, relativ zähen, schleimigen Verbänden angeordnet findet. Hierher ge- hören z. B. die sogenannten K a h m h ä u t e , welche man auf faulenden Infusen etc. häufig antrifft. Mkroskopisch constatirt man in solchen Fällen die Gallerthüllen der Einzelzellen miteinander verquollen, die Protoplasmakörper der Zellen durch die Gallerthüllen auseinander ge- halten und in meist regelmässiger Anordnung in der Gallertmasse vertheilt. Solche Bakterienmassen bezeichnet man als Z o o g 1 o e a oder Palme IIa. Ein Beispiel zeigt Taf. 11, Fig. 9. Beobachtet man Bakterien im lebenden Zustande in der Flüssigkeit, in der sie gewachsen sind, oder in einem anderen flüssigen Medium, welches ihre Weiterexistenz zulässt, so bemerkt man, dass die Zellen sich bewegen. Die Bewegungen, die man beobachtet, smd aber zweierlei verschiedener Art. Erstens zeigen die Bakterienzellen die Brown 'sehe Bewegung oder Molekularbewegung, wie sie kleinsten, in Flüssigkeiten suspendirten Körperchen stets zukommt. Die Zellen tanzen hin und her, auf und ab; die Bewegung jedes einzelnen Indi- viduums steht in Beziehung zu der des Nachbars. Ausserdem koiimit aber eine Eigenbewegung bei den Bakterien vor. Die Eigen- bewegung ist nicht allen Arten eigenthümlich, sondern auf bestimmte Arten beschränkt. Sie findet sich zunächst ganz allgemein, ohne Aus- nahme, bei den Spirillen und Kommabacillen (Vibrionen). Ferner findet sie sich bei einer grossen Reihe von B a c i 1 1 e n a r t e n , ^) Umgekelirt trifft man in jungen Culturen wirklicher „Spirillen "-Arten ganz gewöhnlich zahlreiche kommaförniige Individuen an. 14 A. Allgemeines. während die ü])rigeii Bacillenarten ohne Eigenbewegung sind. Bei den Mikrococcen kennt man Eigenhewegung nm* hei wenigen Arten. ^) Um eine beobachtete Bewegmig von Bakterien als Eigenbewegung an- zusprechen, ist es nöthig, den Nachweis zu führen, dass das sich be- wegende Individuum mit den Bewegungen der Nachbarn in keinem Zusammenhange stehende Ortsveränderungen ausführt. Dies ist manch- mal gar nicht so sehr leicht zu entscheiden. Die Eigenbewegung kann zwar eine sehr lebhafte sein. Besonders bei Spirillen und Vibrionen, aber auch bei Bacillen, findet man nicht selten so lebhafte Bewegungen, dass es recht schwer wird, sich ohne ^Yeiteres ein deutüches Bild der Gestalt der Zellen zu verschaffen; die Schrauben oder Stäbchen schiessen pfeilschnell durch das Gesichtsfeld, um nur für kurze Augenl)licke hier oder da auszuruhen. Auf der anderen Seite aber konmien (bei Bacillen) so matte und träge Eigenbewegimgen vor, dass es oft nicht leicht wkrd, dieselben von Molekularbewegungen zu unterscheiden. ^- Die Eigenbewegung der Bakterienzellen wii'd (nach Ermittelungen von Koch und von Loefflerj stets durch sogenannte Geissei- fäden vermittelt, feinste fadenförmige Gebilde, welche meist an den Enden der Zelle angebracht sind und durch die von ihnen ausgeführten flimmeiTiden Bewegungen Ortsveränderungen der Zelle veranlassen. Spirillen und Bacillen mit Geisselfaden zeigt Taf. ni, Fig. 15 ; grosse Vibrionen mit ihren Geissein sieht man auf Fig. 18 derselben Tafel. Taf. X, Fig. 57, zeigt die Kommabacillen der Cholera asiatica mit ihren Geisseifäden. Findet man bei diesen Beispielen die an den Enden der Bakterienzelle angehefteten Geisseifäden in der Einzahl, so giebt es andererseits zahlreiche Fälle, in denen ein regelrechter Büschel von Geisseifäden an dem Ende der Zelle angebracht ist. So zeigt Taf. HI, Fig. 16, grosse Spirillen, Fig. 17 grosse Bacillen mit endständigen Geisselbüscheln. Die Länge und Gestalt der Geissein sind bei den verschiedenen Bakterienarten verschieden. Die Anheftimgsstelle der Geissein liegt, wie wir bereits sagten, meist an dem Ende der Zelle: es sind jedoch eine Reihe von Bacillenarten aufgefunden worden, bei denen jedes Individuum eine ganze (mitunter ausserordenthch grosse) Anzahl von Geisseifäden trägt, die von seinen Seitenwänden aus- gehen.-) Ein Beispiel hierfür bildet der Typhusbacillus (cf. Taf. VHI, Fig. 46). ^) Die erste eigenbewegliche Mikrococcenart , deren Keinzüclitung gelang, und die genau studirt worden ist, wurde von Ali -Cohen (Centralbl. f. Bakt. Bd. 6. ISSil. p. 33) in Trinkwasser aufgefunden („Micrococcus agilis"). -) Die erste derartige Beobachtung haben C. Fränkel und R. Pfeiffer (Mikrophot. Atlas der Bakterienkunde. Lief. 5 18S9. Tafel 24) publicirt. I. Allj^emeine Morphologie und Systematik der Bakterien. 15 Wir hatten oben gesehen, dass die Vermehrung der Bakterien durch Spaltung jeder einzelnen Zelle in zwei Zellen geschieht. Denken wir uns irgend eine Bakterienart unter günstigen äusseren Bedingungen, denken wir uns den Nährboden möglichst günstig zusammengesetzt, die Temperaturverhältnisse günstig, und denken wir diese Bedingungen ungeändert in gleicher Weise fortbestehen, so wäre kein Grund ein- zusehen, weshalb die Bakterien sich nicht in infinitum in gleicher Weise weiter theüen sollten. Nun liegen aber die Verhältnisse in Wirklichkeit nie derartig. Jeder Organismus lebt von gewissen Nähr- substanzen ; er verbraucht diese Nährsubstanzen ; bei semem Stoffwechsel bilden sich gewisse Abfallproducte, welche er nicht weiter zu verwenden vermag. Auch der günstigste Nährboden, auf welchem Bakterien wachsen, wird in kürzerer oder weiterer Frist erschöpft an nothwen- digen Nahrungsstoffen, er wird ausserdem mehr oder weniger beladen mit Stoffwechselproducten der Bakterien. Höchstens im kreisenden Blute eines inficirten Thieres könnten sich dort vegetirende Bakterien für gewisse Zeit in einem Zustande befinden, der den oben supponirten idealen Verhältnissen ähnlich ist; sie würden jeden Augenbück neue Nahrung erhalten, und ihre Abfallproducte würden ebenso ständig ent- fernt vv erden. Gemeinhin aber liegen die Dinge so, dass mit fort- schreitendem Bakterienwachsthum der Nährboden sich verschlechtert. Die letzten Consequenzen davon würden die sein, dass die Bakterien auf dem Nährboden nicht mehr zu leben vermögen und zu Grunde gehen, absterben. Das geschieht nun in der That sehr häufig. (^Wir sehen dann an den Bakterienzellen zunächst sogenannte Absterbe- erscheinungen, Involutionserscheinungen auftreten.) Die Zellen blähen sich auf, werden voluminöser, Mssbildungen, Schnörkel- formen der mannichfachsten Gestaltung bilden sich aus, das Protoplasma durchsetzt sich mit „Vacuolen", verhext seine normalen chemischen Eigenschaften (z. B. färbt sich lückenhaft und schlecht mit 'Anilin- farben), der Contour der Zellen wird undeutlicher; und dann smd die Zellen nicht mehr fähig, sich weiter zu vermehren, selbst wenn sie auf frischen Nährboden übertragen werden: sie sind abgestorben. In- volutionsformen bei Milzbrandbacillen zeigt Taf. VI, Fig. 34; auf Taf. X, Fig. 56, sieht man Formen, wie sie bei der beginnenden Involution der Choleravibrionen auftreten. Unter gemssen Bedingungen aber giebt die Verschlechterung des Nährbodens resp. die Erschöpfung desselben an Nahrungsstoffen Ver- anlassung zu der Bildung eigenthümlicher Fruchtformen, welche, teleologisch betrachtet, die Bestimmung haben, das Weiterbestehen der Art, solange die ungünstigen äusseren Verhältnisse andauern, zu ver- 16 A. Allgemeines. mittein. Es ist dies die Bildung der Sporen (Dauersporen). ^) /Die Bildung von Dauersporen kommt fast ausschliesslich bei Bacillen vor; sie ist aber nur einer Anzahl von Bacillenarten eigenthümlich, während sie bei den anderen Bacillenarten fehlt.J Sie ist femer aus- nahmsweise beobachtet bei ganz vereinzelten Spirillenarten ; sie soll auch bei Sarcinen'-) vorkommen können. Die Sporenbildung tritt aber bei den sporenbildenden Ai'ten nicht ohne Weiteres jedesmal ein, wenn der Nährboden sich verschlechtert; es gehören hierzu noch ganz be- sondere Bedingungen, die für die verschiedenen Arten verschieden sind. Der Vorgang bei der Sporenbildung ist im Allgemeinen der, dass zunächst eine kleine Stelle des Bacillenleibes anfängt stärker licht- brechend zu werden, dass dann diese Stelle an Ausdehnung zunimmt und sich dm-ch eine feste, eigene Membran abschliesst gegen das übrige, unveränderte Bacillenprotoplasma. Es findet sich dann an der ge- nannten Stelle ein homogenes, ölartiges, das Licht stark brechendes, bei hoher Einstellung des Miki'oskoptubus stark glänzend, bei tiefer Einstellung dunkel erscheinendes, meist länglichrund gestaltetes Kör- perchen, welches von der erwähnten Membran mnschlossen vnvd. (Vgl. hierzu Taf. VI, Fig. 36 : Lebende Milzbrandbacillenfäden mit Sporen.) Vor der Sporenbildung kommen übrigens die eigenbeweglichen Bacillen- individuen stets zur Ruhe, Ist die Spore in der geschilderten Weise fertig gebildet, so beginnt der übrige Bacillenleib zu zerfallen, und die Spore ist dann isolirt; sie bleibt dann unverändert, bis sie nach längerer oder kürzerer Zeit wieder auf einen günstigen Nährboden geräth. Dort keimt dann die Spore zu einem Bacillus aus, welcher sich durch Zweitheüung in der bekannten Weise weiter vermehrt. Die Sporen bezeichnet man als Dauerformen oder reproductive Formen gegenüber den sich zweitheilenden Formen, die man als vegetative oder als W u c h s f o r m e n bezeichnet. Die Auskeimung der Spore, die Sporenkeimung, geht bei den verschiedenen Bacillen- arten in verschiedener Weise vor sich. Bei dem Milzbrandbacillus z. B. verlängert sich die Spore in ihrer Längsachse, der Inhalt verliert sein glänzendes Aussehen, die Sporenmembran verwandelt sich ohne W^eiteres in die Bacillenmembran, der Bacillus ist fertig. Bei anderen Bacillenarten kommt der Bacillus durch ein Loch in der Membran der ^) Die Thatsacbe, dass bei Bakterien Sporenbildung vorkommt, wurde 1872 von F. Cobn entdeckt. (Beitr. z. Biol. d. Pfl. Bd. 1. Heft 2. 1872. p. 145, 17G; Heft 3. 1S75. p. ISS.) -') G. Hauser, Ueber Lungensarcine. (Sitz.-Ber. Pbys.-Med. Soc. Erlangen 18S7. [Müncben ISSS.] p. 20.) I. Allgemeine jMorpbologie und Systematik der Bakterien. 17 Spore aus der letzteren heraus, die Sporeumembran kann dem jungen Bacillus wie eine Kappe aufsitzen etc. ^) Die Sporenbildung- kann in der Mitte des Bacillus auftreten (mittel ständige Sporen), oder sie kann an einem Ende des Ba- cillus auftreten (end ständige Sporen). In dem letzteren Falle kommt es dann, wenn die Bacillen einzeln liegen, zur Bildimg soge- nannter Köpfchenbakterien, Bacillen mit Köpfchensporen, Trommelschläger formen. Bei manchen Bacillenarten , welche mittelständige Sporen bilden, kommt es bei der Sporenbildung zu einer dem Sitze der Spore entsprechenden stärkeren Auftreibung des Stäb- chens in der Mitte ; sind nun die Enden des Stäbchens zugespitzt , so resultirt eine deutliche Spindelform. Solche Formen bezeichnet man als Clostridium {^ot7]Q =- Spindel). Auf Taf. VI, Fig. 36, und auf Taf. VII, Fig. 37, "sind mittelständige Sporen (Milzbrand), auf Taf. Vn, Fig. 40, endständige Sporen (Tetanus) dargestellt. Man sieht auf Fig. 37 und 40 das Bacillenprotoplasma dm'ch die angewandte Anilinfärbung tmgirt (dunkel), während die Sporen mehr oder weniger ungefärbt (hell) geblieben sind. Diesell)e Erscheinung sieht man auch auf Taf. IV, Fig. 19 (Bacillus subtilis mit Sporen), sowie an den sporen- haltigen Leptothrixfaden, welche auf Taf. IV, Fig. 21, dargestellt sind. Es hängt dieses diflferente Verhalten des Bacillenprotoplasma und des Sporenleibes gegen Farbflüssigkeiten auf das Engste zusammen mit der Verschiedenheit der phjsiologischen Eigenschaften dieser beiden Dinge im Allgemeinen. Die Bacillensporen sind echte Dauerformen. ^Sie sind durch eine Membran gegen die Aussenwelt abgeschlossen. welche von einer solchen Resistenz gegen äussere Einwirkungen ist, wie man sie sonst in der organischen Natur nicht wieder findet, und die speciell mit der Resistenz des Bacillenkörpers gegen äussere An- griffe gar nicht zu vergleichen ist.^ So sehen wir auch die Farbflüssig- keit in den Bacillenkörper eindringen, von der Sporenmembran dagegen zurückgehalten werden. Die besprochene Art der Sporenbildung bezeichnet man als die endogene Sporenbildung, die Sporen als endogene Sporen, die 'Batterfeharten, bei denen diese Bporenbildung auftritt, als e n d o s pore Bakterienarten. Einzelne Autoren , namentlich d e B a r y und H u e p p e , nehmen daneben noch eine andersartige Sporenbildung an : die Art hrospor enbil düng (arthrospore Bakterien). Sie kommt nach de Bary allen den Bakterienarten zu, welche nicht endospor sind. Hier sollen einzelne Zellen, die sich zunächst in nichts von ihren ^) Vergl. A. Koch, Bot. Ztg. 18SS. No. 18—22. Günther, Bakteriologie. 4. Auflage. 18 A. Allgemeines. Geschwistern unterscheiden, entweder ohne Aenderung der Form, oder nachdem sie sich etwas vergTÖssert haben und event. etwas derhwandiger geworden sind, ohne Weiteres Sporenqualität annehmen: d. h. diese Zellen dienen, wähi'end die übrigen absterben, zum Ausgangspunkte einer späteren neuen Bakterienvegetation. Von einer ähnlichen Resistenz, wie sie die endogenen Sporen gegen äussere Angriffe zeigen, scheint bei den „Arthrosporen" („Gliedersporen") nicht die Rede zu sein. Die „Arthrosporen" können deshalb auch nicht als Dauerformen in dem Sinne der den endogenen Sporen zukommenden Eigenschaften an- gesehen werden, und die ganze Frage nach den Arthrosporen hat mehr theoretische als praktische Bedeutung. Von Wichtigkeit ist es dagegen stets, zu Avissen, ob eine bestinmite Bakterienart wirkliche Dauer- fornien, d. h. mit besonderer Resistenz ausgestattete Gebilde, zu produciren vermag; diese Eigenschaft aber findet sich nur bei den endo Sporen Arten. Die Bakterien, soweit wir deren allgemeine Morphologie bisher be- trachtet haben, zeigen in ihren Formverhältnissen die übereinstimmende Eigenthümliclikeit, dass eine jede einzelne Species eine bestimmte, stets wiederkehrende Form der Einzelzelle aufweist. Handelt es sich mn eine Bacillenspecies , bei der das Individuum abgestumpfte Enden hat, so kehren diese abgestumpften Enden bei der weiteren Vermehrung der Art stets imverändert wieder; ein Miki-ococcus von bestinnnter Grösse bildet bei seiner weiteren Vermehrung stets wieder Miki'ococcen derselben Grösse etc. C Mit einem Worte: eine jede Bakterienart hat die Eigenschaft der Formconstanz.y Oben haben wir schon gesehen, dass während des Theilungsprocesses die Individuen sich verlängern, und dass unter ungünstigen äusseren Verhältnissen sich Formände- rungen, sogenannte Involutionsformen, auszubilden vemiögen. Die Eigenschaft der Formconstanz gilt also nur ftir das Stadium der eben abgeschlossenen Theilung und für im Uebrigen normale, günstige äussere Verhältnisse. ^) Man hat nun, und dieser Standpunkt Arä'd namentlich von Zopf vertreten, gegenüber den Bakterien mit constanter Wuchsform auch sogenannte pleomorphe Bakterien arten statuirt. Hierhin ge- hören besonders 'die im Wasser vorkommenden Gattungen Cladothrix, Beggiatoa und Crenothrix. Dieselben treten in Fäden auf, welche in ihrer Dicke z. Th. etwa dicken Bacillenarten entsprechen, z. Th. ^) Für die diagnostische Beurtheüimg bestimmten vorliegenden Bakterienmaterials wichtig ist die Thatsache, dass eine und dieselbe Form der Einzelzelle verschiedenen Bakterienspecies zukommen kann. Man darf also aus der Form, der Einzelzelle nicht ohne Weiteres auf die Art schliessen. I. Allgemeine Mori^hologie und Systematik der Bakterien. 19 allerdings eine erheblich gi'össere Dickenausdehnung- besitzen. UClado- thrLx ist durch Z^veigbildung ausgezeichnet, /Beggiatua zeigt Schwefel-, könichen im Protoplasma eingelagert, '■ Crenothrix besitzt eine eisenoxjd- haltige Hülle. Alle drei Gattungen zeigen in ihren Fäden *emen deutlichen Gegensatz von Basis und Spitze : sie sind durch Spitzen- wachsthum ausgezeichnet. In den Entwickelungskreislauf aller drei sollen die verschiedensten Formen (Stäbchen, Coccen etc.) gehören. Die Koch'sche Schule rechnet diese Gattungen nicht zu den Bak- terien, sondern zu den niederen Algen. ^) Auf Taf. IV, Fig. 22, findet man eine Cladothrix (Cladothrix dichotoma Cohn?) bei lOOOfacher Vergrösserung, auf derselben Tafel, Fig. 24, eine Gelatine- plattencolonie desselben Organismus bei lOOfacher Vergrösserung ab- gebildet.") Taf. IV, Fig. 23, zeigt eine Crenothrix-^) bei 250facher Vergrösserung; die braunen Eisenoxydhydrat-Einlagerungen erscheinen auf dem Photogramm dunkel. ^) Was speciell Cladothrix angeht, so kann diese zweigbildende Art logischer Weise schon deshalb nicht zu den Bakterien gestellt werden, weil wir Bak- terien als „Spaltpilze", als durch Spaltung, durch Zweitheiluug (cf. oben p. 10) sich vermehrende einzellige Organismen definiren, eine Zweigbüdung aber vor- aussetzen würde, dass sich an der Zweigstelle aus einer Zelle nicht zwei, son- dern drei Tochterzellen bildeten, oder aber, dass an dieser Stelle sich ausser der Zweitheilung eine Sprossung etabhrte. -) Diese Cladothrix, welche ich seit einer ganzen Eeihe von Jahren häufig in Berliner Leitungswasser angetroffen habe , wächst in Nährgelatine und auf Agar bei Zimmertemperatur gut, verflüssigt die Gelatine sehr langsam, färbt die Nährböden im Umkreise der Colonien braun. ■ •^) Diese Crenothrix wurde gelegentlich in Spreewasser gefunden. Sie wächst auf unseren künstlichen Nährböden nicht. 2* IL Allgemeine Lebensbedingungen der Bakterien. Desinfeetion. Sterilisation. Antiseptik. Aseptik. Die Bedingungen, welche vorhanden sein müssen, damit Bakterienwachsthum ermöghcht werde, sind je nach den verschiedenen Bakterienarten verschieden. Im Allgemeinen ist zunächst ein gewisser Wassergehalt des Nährbodens erforderlich, ohne den ja überhaupt organisches Leben imdenkbar ist; femer erfordern die allermeisten Bakterienarten einen Gehalt des Nährbodens an höheren organischen Verbindungen, da sie ihres Chlorophjdlmangels wegen nicht im Stande sind, aus der Kohlensäure der Luft ihren Kohlenstoff])edarf zu ent- nehmen. Es bilden jedoch, wie bereits oben angegeben, einzelne Arten hierin eine Ausnahme ; diese besitzen Chromophjdl und vermögen Kohlen- säure resp. Carbonate zu zerlegen. ^) Diese wenigen ChromophA'll führenden Bakterienarten sind auf Licht angewiesen ; ^) für die übrigen Arten jedoch, also für die grosse Mehrzahl der Bakterien, ist das Licht durchaus kein wachsthmnsbegünstigender , sondern durchgängig ein wachsthumsschädigender, nnd zwar sehr erheblich schädigender Factor.^) Alle Bakterien sind wegen des Stickstoffgehaltes ihres Protoplasma- körpers auf stickstoffhaltigen Nährboden angewiesen: am- besten ^) Hueppe und Heraeus (60. Vers. Deutscher Naturf. u. Aerzte. Wies- baden 1887. — ref. Centralbl. f. Bakt. Bd. 3. 1888. p. 419) haben die wichtige Thatsache festgestellt, dass bei Bakterien auch eine „Chlorophyll Wirkung ohne Chlorophyll" vorkommt. D. h. es giebt chromophyllfreie Bakterien, welche ihren Kohlenstoffbedarf durch Assimüirung von Kohlensäure (in Form von Aramonium- carbonat geboten) decken. Winogradsky (x\.nn. de l'Inst. Pasteur 1890) hat eine derartige Bakterienart reincultivirt und (wegen ihrer nitrificirenden [Oxydation des Ammoniaks] Eigenschaften) als ,,Nitromonas" bezeichnet. (Siehe den nächsten Ab- schnitt bei „Nitrification"). -) cf. Th. W. Engelmann. Die Purpurbakterien und ihre Beziehungen zum Licht. (Bot. Ztg. 1888. Nr. 42—15). ') cf. weiter unten, Schluss dieses Abschnittes. IL Allgemeine Lebensbedingungen der Bakterien. 21 eignen sich als stickstoffhaltiges Nährmaterial Eiweissstoffe ; jedoch scheinen für viele Arten selbst die einfachsten Stickstoffverbindungen, namentlich Ammomaksalze, als Stickstoffquellen zu genügen.^) Der für den Aufbau der Körpersubstanz der Bakterien nothwendige Schwefel wird nach den Ermittelungen von Eubner''^) ganz allgemein orga- nischen Schwefelverbindungen entnommen. Die Existenz der sogenannten „Schwefelbakterien" (cf. oben p. 10) ist an die Gegenwart freien Schwefelwasserstoffs gebunden, den diese Organismen durch einen Oxy- dationsprocess zunächst in Schwefel, dann in Schwefelsäui-e überführen;'^) die „Eisenbakterien" (cf. oben p. 10) bilden das in ihrer Hülle eingelagerte Eisenoxyd durch einen bei ihrem Lebensprocesse stattfinden- den Oxydationsvorgang aus Eisenoxydul, welches in dem Wasser ihrer Umgebung gelöst ist.*) Bekanntlich sind viele Bakterienarten Krankheitserreger, d. h. sie vermögen, in einen passenden Thierorganismus gelangt, auf Kosten des lebenden Materiales dieses Organismus sich zu vermehren. Man bezeichnet solche Bakterienarten als pathogene oder para- sitische gegenüber den nicht pathogenen oder sapro- phytischen Arten, welche nur auf todtem Materiale leben. Unter den parasitischen Arten giebt es nun solche, die in der Natur, unter ge- wöhnlichen Verhältnissen, nur im Körper des lebenden Thieres resp. bestimmter Thierspecies , nicht auf todtem Materiale, zu gedeihen ver- mögen. Diese bezeichnet man als obligate (strenge, echte) Parasiten gegenüber den facultativen (gelegentlichen) Pa- rasiten, die sowohl im lebenden Thierkörper wie auch auf todtem Nährboden zu wachsen vermögen. Von den obligat-parasitischen Bak- terienarten lassen sich manche auf bestimmten, künstlich zubereiteten Nährböden cultiviren ; bei anderen obligaten Parasiten ist die künstliche Cultur bis jetzt ül)erhaupt nicht gelungen. Ferner ist die chemische Reaction des Nährbodens für das G-edeihen der Bakterien von erheblichem Belang. Die meisten patho- genen Arten wachsen am besten bei leicht alkalischer Eeaction des Nährbodens. Gegen Säuren sind die Bakterien im All2:emeinen mehr ^) Ueber eine neuerdings vielfach angewendete eiweissfreie Nährlösung für Bak- terien, die sog. „Uschinsky'sche" Lösung, siehe hinten Abschnitt V, 2. — Ueber die Pixirung freien atmosphärischen Stickstoffs durch Bakterien, wie sie in den Wurzelknöllchen der Leguminosen stattfindet, vgl. die zusammen- fassende Uebersicht von Stutzer (Centralbl. f. Bakt. Abth. II, Bd. 1. 1895. p. 68 ff.). '^) Arch. f. Hjg. Bd. l(j. 1892. •■') Winogradsky, Bot. Ztg. 1887. No. 31—37. *) Winogradsky, Bot. Ztg. 1888. No. 17. 22 A. Allgemeines. oder weniger empfindlich; jedoch verhalten sich, wie in allen übrigen Lehensbedingungen, anch hierin die einzelnen Arten verschieden von einander. Während z. B. der Choleranbrio schon durch sehr geringe Mengen freier Säure im Nährboden in seiner Ent^nckelung gehenunt wird, verträgt der T3^3husbacillus erheblich grössere Mengen der freien Säure. Ganz ausserordentlich verschieden verhalten sich die Bakterien zu dem freien Sauerstoff. Yiele Ai-ten wachsen nur bei fortwährender ungehinderter Sauerstoffzufrihr (obligate Aeroben), bei anderen wird im Gegentheil durch die geringste Spur freien Sauerstoffs die Entwickelung sofort sistirt (obligate Anaeroben),^) eine dritte Ab- theilung nimmt eine Mittelstellung ein (f a c u 1 1 a t i v e A n a e r o b e n). '-) Zu den letzteren, den facultativen Anaeroben, gehören die meisten pathogeneu Bakterienarten. Es giebt aber mehrere wichtige pathogene Arten, welche obligate Anaeroben sind. Von ausserordentlicher Bedeutung für das Bakterienwachsthum sind femer die Temperaturverhältnisse. Auch hier zeigen wieder die verschiedenen Species verschiedenes Verhalten. Zunächst hat jede Art eine untere und eine obere Temperatm-grenze (Tempe- raturminimum, Temperaturmaximum), innerhalb deren über- haupt ein Wachsthum möglich ist. Die günstigste Temperatur fifr die Vemiehrung einer Bakterienart bezeichnet man als ihr Temperatur- optimum. Im Allgemeinen findet Bakterienwachsthum statt zwischen ') Nach Beyerinck (Centr. f. Bakt. Abth. II. Bd. 1. 1S95. p. 109. Aiim.) giebt es zwei Klassen von echten Anaeroben. Die eine Klasse vermag die letzten Spuren freien Sauerstoffs aus den Nährmedien zu absorbiren, wobei die mor- phologisch so characteristische „Sauerstoffform" auftritt (Die Butylalkoholgährung. Amsterdam. 1893. p. 27). Die zweite Klasse besitzt eine solche Sauerstoffform nicht und fordert absolute Abwesenheit des freien Sauerstoffs, um zur Entwickelung zu kommen. Aerobe sowohl wie anaerobe Bakterien nehmen bei ihrem "Wachsthum Sauer- stoff auf: die aeroben entnehmen ihn aus der atmosphärischen Luft, die anaerobeu spalten ihn aus dem Nährboden ab. Alle Bakterien , soweit untersucht , geben bei ihrem Wachsthum Kohlensäure ab (cf. W. Hesse, Zeitschr. f. Hyg. Bd. 15. 1893. p. 17 ff.). 2) Beyerinck (Centralbl. f. Bakt. Bd. 14. 1893. No. 25) hat Methoden angegeben, ,,Athmungsfiguren" beweglicher Bakterien darzustellen ; diese Figuren (welche dadurch entstehen, dass die in Wasser etc. vorhandenen resp. in dasselbe eingebrachten Bakterienzellen die ihnen bezüglich der Sauerstoffspannung günstigste Stelle der Flüssigkeit aufsuchen und dort sichtbare Anhäufungen Ijüden) zeigen ohne Weiteres das grössere oder geringere Bedüi-fniss nach freiem Sauerstoff, welches der untersuchten Bakterienart zukommt. Beyerinck unterscheidet unter den Athmungs- figuren drei Typen: den ,,Aerobentypus", den „Anaerobentypus" und den zwischen beiden stehenden „Spii'iUentypus". II. AUgemeine Lebensbedingungen der Bakterien. 23 Temperaturen von etwa 5^ C. imd etwa 45*^ C. Die Saprophyten wachsen im Allgemeinen besser bei niedrigerer, die Parasiten besser bei höherer Temperatur. Das Temperaturoptimum für die ersteren liegt gemeinhin um 20*^ C. herum, das der letzteren bei Körpertemperatur.^) Einzelne Bakterienarten jedoch fallen bezüglich ihrer Temperatur- ansprüche vollständig aus dem vorstehend gezeichneten Rahmen heraus. Globig-) hat in den oberflächKchen Bodenschichten in weitester Ver- breitung das regelmässige Vorhandensein verschiedener Bacillenarten nachgewiesen, welche sich bei Temperaturen von 50 — 70^ C. zu ent- wickeln vermögen,'^) und Forst er hat Bakterienarten entdeckt, die die Eigenschaft haben, bei 0*^ C. sich zu vermehren.'^) Bezüglich der Bedingungen, welche die Bakterien an den Nähr- boden resp. an die Aussenverhältnisse stellen, ist im Allgemeinen noch darauf aufmerksam zu machen, dass man bei vielen Arten eine all- mählich zu Stande kommende Gewöhnung (Anpassung) an einen der Art Anfangs nicht zusagenden Nährboden resp. an nicht zu- sagende äussere Verhältnisse beobachtet hat. Besonders bei zahlreichen pathogenen Arten hat man ein derartiges Verhalten constatirt. Freihch sind damit stets gewisse Aenderungen auch in den Lebensäusserungen verknüpft, die manchmal den Verlust sehr wichtiger, für die Art ur- sprünglich characteristischer Eigenschaften bedeuten. Bezüglich der Anpassungsvorgänge ist sehr wichtig die von D i e u d o n n e ^) neuerdings ^) Das gilt nicht nur für solche Bakterien, die für Warmblüter pathogen sind. So fanden Emmerich und Weibel als Erreger einer Forellenseuche eine Bakterienart, deren Temperaturoptimum zwischen 10*^ und IS*' C. liegt (Arch. f. Hyg. Bd. 21. 1S94. p. 9). ■-) Zeitschr. f. Hyg. Bd. 3. ISST. ") Weitere Mittheilungen über solche bei hohen Temperaturen wachsende, ,,thermophile" Bakterienarten lieferten Miquel (Ann. de micrographie 188S) so- wie Macfadyen und Blaxall (Journ. of pathol. and bacteriology. Bd. 3. 1894), ferner Rabin owitsch (Zeitschr. f. Hyg. Bd. 20. 1895). Es handelt sich um Bacillenarten, die sich im Boden, im Fluss- und Seewasser, ferner im Darm der Thiere ganz regelmässig vorfinden , die facultativ anaerob , nicht pathogen sind, und «.lie sämmthch ganz ausserordentlich widerstandsfähige Sporen (cf. p. 28) bilden. ^) Centralbl. f. Bakt. Bd. 2. 1887. p. 340. — Auch Fischer (Centralbl. f. Bakt. Bd. 4. 1888. No. 3) fand, und zwar im Kieler Hafen und Boden, eine Eeihe von Bakterienarten, die bei O*' C. zu wachsen vermögen. — Fernere Unter- suchungen von Forst er über den Gegenstand (Centralbl. f. Bakt. Bd. 12. 1892. No. 13) haben ergeben, dass in unserer Umgebung (Wasser, Boden, Strassenschmutz, Milch etc.) sigh gewöhnhch zahlreiche Keime finden, welche bei 0** C. zu gedeihen vermögen ; dieselben gehören nur wenigen Arten zu. Sie finden sich nicht etwa nur im Winter, sondern auch im Sommer. '') Arb. a. d. Kais. Ges.-A. Bd. 9. 1894. 24 -Ä-- Allgemeines, festgestellte Thatsache, dass bestimmte Bakterienarten unter Umständen dadurcli an T e m p e r a t ii r y e r li ä 1 1 n i s s e , die ihnen a priori nicht zusagten, gewöhnt werden können, dass man eine grössere Eeihe von Umzüchtungen Yornimmt mit ganz allmählich geänderten Temperaturbedingungen. Vorstehend haben wir Yersucht, die wichtigsten Punkte, auf die es für das Bakterienwachsthimi im Allgemeinen ankommt, zu skizziren. Eine jede Art stellt bezüglich jedes einzelnen Punktes ihre besonderen Ansprüche. Sind die Bedingungen resp. eine oder mehrere derselben ungünstig, so kommt es auf den Grad des MissYerhältnisses an be- züglich der daraus resultirenden Folgen. Bei minder ungünstigen Verhältnissen Avird das Wachsthum nur Yerzögert oder auch inhibirt ( E n t w i c k e 1 u n g s h e m m u n g ) , die weitere Vermehrungsf ähi gkeit aber noch nicht aufgehoben: bei längerer Andauer der ungünstigen Verhältnisse resp. wenn die Qualität der Verhältnisse eine noch un- günstigere wird, kann auch die fernere Vermehrungsfähigkeit endgültig aufgehoben werden (Vernichtung). Was speciell ungünstige Temperatureinflüsse angeht, so ist darüber im Allgemeinen folgendes zu sagen: Setzt man eine Bakterienart Temperaturen aus, die ausserhalb der für ihr Wachsthum noch geeigneten Grenztemperaturen liegen, so tritt zunächst eine Sistirung der Entwickelung ein. Die weiteren Wirkungen sind jedoch ganz Yerschieden, je nachdem die einwirkende Temperatur unterhalb des Temperaturminimums oder oberhalb des Temperaturmaximums der Art liegt. Selbst die niedrigsten künstlich zu erzeugenden Temperaturen Yermögen im Allgemeinen auch bei längerer Einwirkung die fernere Entwickelungsfähigkeit der Bakterien nicht aufzuheben, während andrer- seits bei Temperaturen you 55" bis 60« C. die YegetatiYen Formen der Bakterien im Allgemeinen in kurzer Zeit sicher getödtet werden. Ganz anders freilich Yerhalten sich die Bacillen s p o r e n , zu deren Ver- nichtung stets ganz erheblich höhere Temperaturen erforderlich sind. Liegen die Bedingungen, und zwar nicht nur die Temperatur- bedingungen, sondern die gesammten Lebensbedingungen, in einem gegebenen Falle zufällig so, dass in jedem einzelnen Punkte die An- sprüche auf das Beste erfüllt sind, so ist das Wachsthum das üppigste, schnellste, das überhaupt möglich ist. Gewöhnlich liegen die Bedingungen aber nicht in allen Punkten so günstig. Es ist nun in dieser Beziehmig äusserst interessant, dass ungünstige Bedingungen des einen Punktes durch günstige emes anderen Punktes compensirt werden können. Zum besseren Verständniss dieser wichtigen Thatsache will ich einige Bei- spiele anführen. Der CholeraYibrio wächst auf geeignetem Nährboden IL Allgemeine Lebensbedingungen der Bakterien. 25 bei Zimmer- sowohl wie bei Brüttemperatm-: bei der letzteren wächst er aber stets erheblich besser. Der Cholera\ibrio wächst ferner am besten auf einem leicht alkalischen Nährboden ; gegen geringste Mengen fi'eier Säure zeigt er sich empfindlich. Bringt man ihn nun auf die (leicht sauer reagirende) gekochte Kartoffel, so wächst er bei Zimmer- temperatur hier nicht; er wächst aber auf diesem ihm recht wenig zusagenden Nährboden, wenn man denselben in den Brütschrank stellt. Es ist hier also die ungünstige chemische Beschaffenheit des Nährbodens compensirt worden durch die sehr günstigen Temperaturverhältnisse. Etwas Analoges beobachtet man z. B. auch bei den Milzbrandbacillen. welche ebenfalls sowohl bei Zimmer- wie bei Brüttemperatur, bei der letzteren aber stets erheblich besser, gedeihen. Bringt man diese Organismen in eine Nährgelatine (cf. weiter unten), der so viel Sublimat zugesetzt ist, dass 400 000 Theile des Nährbodens 1 Theil Sublimat enthalten, so wachsen hier die Milzbrandbacillen bei Zimmertemperatur (16 — 18^ C.) durchaus nicht. Bringt man die Sublimatgelatine aber in den Brütschrank, so gedeihen nun die Milzbrandbacillen auf ihr. Bei Brüttemperatur (36^ C.) wirkt entmckelungshemmend auf IMilz- brandbacillen erst etwa das Zehnfache von demjenigen Gehalt des Nähr- bodens an Sublhnat, der bei Zimmertemperatur das Wachsthum ver- hindert (B e h r i n g)}) Veränderungen m den Culturbedingungen haben ausnahmslos eine Veränderung auch der Lebensäusserungen zur Folge. Die letzteren können geringfügiger Natur sein, sich auf Aenderung m der Schnelligkeit des Wachsthums etc. beschränken. Sie können jedoch auf der andern Seite auch sehr wesentlicher Natm* sein und wichtige Umänderungen in dem gesammten Lebensprocesse der Art bedeuten. So wächst z. B. der Bacillus prodigiosus am besten bei Zimmer- temperatur. Er producirt hier auf den Nährböden einen intensiv rothen Farbstoff; Hand in Hand damit geht die Production von Trimethylamin (Geruch nach Heringslake). Züchtet man den genannten Bacillus bei Brüttemperatur, so bleibt sowohl die Farbstoffproduction wie auch die Bildung von Trimethylamin vollständig aus. Im Uebrigen ist das Wachsthum ein sehr gutes bei der Brüttemperatur. Im Anschluss an die geschilderten allgemeinen Lebensbedingungen der Bakterien möge hier ein Kapitel kurz berührt werden, welches in seinen Grundlagen mit den Bedingungen für das Leben und Sterben der Bakterien auf das Engste verknüpft ist: das Kapitel der Des- infection. ') Zeitscbr. f. Hyg. Bd. 9. ISyu. p. 39S. 26 A. Allgemeines. Wenn ii-gend welche Gegenstände desinficirt werden sollen, so heisst das so viel, als: es sollen die an oder in ihnen befindlichen ki-ankheitseiTegenden organischen Keime getödtet werden, ohne dass, falls die zu desinficirenden Gegenstände Gebrauchsgegenstände sind, diese selbst erheblich geschädigt resp. unbrauchbar gemacht werden. Der letztere Punkt, d. h. die Eücksichtnahme auf die fernere Brauch- barkeit der zu desinficirenden Gegenstände, ist aber von untergeordneter Bedeutung gegenüber dem anderen Punkte: der Nothwendigkeit der endgültigen Vernichtung der pathogenen organischen Keime. Wir haben bereits gesehen, dass die Bakterienkeime von sehr verschiedener Kesistenz gegen äussere Einwirkungen sind, je nachdem es sich um vegetative Formen oder um Sporen handelt. Ein Desinfectionsverfahren, welches allgemeine Anwendbarkeit für jedwede Form von In- fectionski'ankheit haben soll, muss demnach so eingerichtet sein, dass durch dasselbe die widerstandsfähigsten Sporen, welche wir bei ki'ank- heitserregenden Bakterien kennen, getödtet werden. Handelt es sich um ein Desinfectionsverfahren, welches nur für die Zerstörung ganz bestimmter Krankheitskeime, nur für die einer einzelnen Infections- k rankheit, bestmimt ist, so braucht dasselbe natürlich nur auf die specielle Natur der in Frage kommenden Krankheitserreger Ftücksicht zu nehmen. Ein dem Begriffe der Desinfection sehr nahestehender Begriff ist der der Sterilisation; man versteht hierunter das Keimfrei- (Steril-) machen irgend welcher Instrumente, Apparate, Nährböden etc., wobei man nicht speciell an krankheitserregende Keime, sondern an Keime von Organii^men überhaupt denkt. Die Tödtung von Bakterienkeimen kann nun hauptsächlich auf zweierlei Art geschehen : durch hohe Temperaturen und durch chemische Mittel (Desinfection smittel). Wenn wir unsere Messer, Scheeren, Platindrähte etc. zum Zwecke der Benutzung bei bakteriologischen Arbeiten keimfrei haben wollen, so werden dieselben in der Flamme des Bunsen'schen Gasbrenners oder in der Spiritus- flamme „ausgeglüht" resp. bis in die Nähe der Glühhitze gebracht. Die den Instrumenten anhaftenden Bakterienkeime werden dabei sämmt- lich augenblicklich zerstört. Wenn wir Leichen von Versuchsthieren resp. die in ihnen befindlichen Bakterien unschädlich machen Avollen, so verbrennen wir die Leichen im Ofen. Diese einfachen Mani- pulationen, bei denen sehr hohe Temperaturen zur Bakterienvemichtimg in Anwendung kommen, sind nicht überall am Platze. Man hat sich deshalb mit niedrigeren Temperaturen zu behelfen gesucht und (früher) mit stark erhitzter (trockener) Luft „desinficirt". II. Allgemeine Lebensbedingungen der Bakterien. 27 Die grandlegenden Versuche von R. Koch und WolffhügeP) haben nun aber gezeigt, dass die trockene heisse Luft ein höchst unzweckmässiges Desinfectionsmittel ist. Damit alle Bakterienkeime getödtet werden, ist dreistündige Einwkung einer Temperatur Ton 140*^ C. nothwendig, und hierbei werden „fast alle Stoffe, welche der Hitze -Desinfection zugänglich sind, mehr oder weniger beschädigt".-) Nichts desto weniger bedienen wir uns in gewissen Fällen auch heute noch der Einwirkung von heisser trockener Luft zum Zwecke der Desinfection, oder besser Sterihsation, wobei aber noch erheblich höhere Temperaturen als 140*^ C. zur Anwendung kommen. Es geschieht dies, wenn wir im Laboratorium trockene leere Glasgefässe oder Metall- instrumente, die ohne Schaden zu nehmen derartigen Temperaturen ausgesetzt werden können, steril, keimfrei machen wollen. Sie werden dann in den Trockenschrank oder Heissluftsterilisations- apparat^) gebracht, einen doppelwandigen Kasten von Schwarzblech, dessen Lmeres mit Hülfe einer untergestellten kräftigen Gasflamme, und zwar durch die den Zwischenraum zwischen den Wandungen durch- streichenden Heizgase der letzteren, in wenigen Mnuten auf 160 — 170*^0. erhitzt werden kann. Die Bakterienkeime werden durch derartig hohe Temperaturen in etwa einer Stunde sämmtlich sicher vernichtet. Viel energischer als die trockene heisse Luft mrkt der heisse Wasserdampf auf Bakterien ein. Die grundlegenden Versuche von Pt. Koch, Gaffky und Löffler*) haben in dem strömenden,'^) ungespannten Wasserdampfe von 100*^ C. ein ebenso bequemes, überall leicht anzuwendendes, wie in der Sicherheit seiner Wirkung kaiun mit irgend einem anderen vergleichbares Desinfectionsmittel kennen gelehrt. Die resistentesten Krankheitskeime, welche wh kennen, sind die Milzbrandbacillensporen. Unter diesen giebt es wiederum je nach der Provenienz des Materiales, wie v. Esmarch*^) gefanden hat, schwächer und stärker widerstandsfähige.^) Die am stärksten wider- 1) antth. a. d. Kais. Ges.-Amte. Bd. 1. ISSl. p. 301 ff. ■-) 1. c. p. 312. ^) Koch, Mitth. a. d. Kais. Ges.-Amte. Bd. 2. 1884. p. 47. *) Mitth. a. d. Kais. Ges.-Amte. Bd. 1. 1881. p. 322 ff. ^) D. h. frei in die Atmosphäre ausströmenden, unter dem gewöhnlichen Atmo- sphärendrucke stehenden. «) Zeitschr. f. Hyg. Bd. 5. 1888. ') Aehnlich ist es auch mit anderem Bakterienmateriale. Grub er (7. int. Congr. f. Hyg. u. Demogr. London 1891. — Centralbl. f. Bakt. Bd. 11. p. 115) constatirte erhebliche Differenzen in der Eesistenz von Staphylococcus aureus-Culturen verschiedener Provenienz. 28 -Ä-- Allgemeines. standsfälligen Milzbrandbacillensporen hielten es allerdings in einem einzigen der sehr zahlreichen v. Esmarch'schen Versuche bis zu zwölf Minuten in dem strömenden Dampfe von 100^ C. aus, ohne ver- nichtet zu werden: die Mehrzahl der Sporen zeigt sich jedoch bereits nach fimf Minuten veniichtet. In dem strömenden Wasserdampfe von 100*^ C. haben wir denmach ein für alle Zwecke der Praxis ge- nügendes, absolut zuverlässiges Desinfectionsmittel. Die modernen Desinfectionsanstalten, wie sie von Gemeindeverwaltungen zum öffentlichen Gebrauche in den Städten eingerichtet werden, wenden fast ausschliesslich den strömenden Wasserdampf an. Im Laboratoriimi bedient man sich für die Zwecke der Desinfection resp. Sterilisation durch Dampf des sog. Dampftopfes, eines mit Filz oder Asbest umkleideten, unten geschlossenen, oben offenen und hier mit einem Deckel versehenen Zinkblechcylinders , dessen Imieres durch einen im unteren Drittel angebrachten Eost in zwei Abtheilungen eingetheilt ist, von denen die untere zum Theile mit Wasser gefüllt wd. während die obere zur Aufnahme der zu sterihsirenden Gegenstände dient; das Wasser wird durch die Flamme eines unter den Kupferblechboden des Cjlinders gestellten starken Gasbrenners in's Kochen gebracht. Noch erheblich stärker keimtödtend als der strömende, ungespannte Dampf von 100*^ C. wirkt der gespannte AVass er dampf von höherer Temperatur. Globig^) fand bei Gelegenheit seiner Studien über im Erdboden vorkommende, bei hohen Temperaturen wachsende Bacillenarten (cf. oben p. 23) einen eigenthümlichen, durch rothe Färbung seiner Colonien ausgezeichneten, übrigens nicht pathogenen Bacillus („rother Kartoffelbacillus"), dessen Sporen eine ganz ungewöhn- liche Widerstandsfähigkeit zeigen. Die letztere geht bei Weitem über die der Milzbrandbacillensporen hinaus; eine grössere Widerstandsfähigkeit organischer Keime ist überhaupt nicht bekannt. Diese Sporen wurden im strömenden Dampfe von lOO^C. erst nach 5^2 — 6 Stunden vernichtet. „ gespannten „ „ 109 — 113*^ C. lebten sie nach 45 Min. noch, „ „ „ 113— 116^ C. wurden sie in 25 ]\Iin. vernichtet, „ 122-1230 C. „ „ ,. 10 „ „ „ „ „ 126 C. „ ,. ,. 3 ,. ,, 1270 c. „ „ „ 2 „ ,, „ „ „ ISO^C. .. ,. augenblickl. zerstört. Aus der vorstehenden Tabelle sieht man, dass mit steigender Tem- peratur die Desinfectionskraft des (gespannten) Wasserdampfes zunimmt, ') Zeitschr. f. Hyg. Bd. 3. ISST. p. 331. n. Allgemeine Lebensbedingungen der Bakterien. 29 und es liegt deshalb sehr nahe, daran zu denken, dass an Stelle der niit strömendem Dampfe arbeitenden Apparate \iel besser die mit ge- spanntem Dampfe arbeitenden Apparate (Autoclav, Digestor) zu benutzen wären. Zweierlei steht jedoch der allgemeinen Einführung der letzteren entgegen. Wenn ein Desinfectionsapparat mit gespanntem Dampfe arbeiten soll, so setzt dies einen hermetisch verschliessbaren Raum voraus, in welchem die Dämpfe entwickelt werden. Es ist aber, bevor der genannte Raum geschlossen wird, unumgänglich nothwendig, dass auch die letzten Spuren atmosphärischer Luft aus demselben ent- fernt werden, dass nur Dampf in ihm enthalten ist. Denn erhitzte Luft ist ein sehr unzuverlässiges Desinfectionsmittel, wie wir oben ge- sehen haben, und es würde durch das Zurückbleiben von Luft in dem Apparate der Erfolg der Desinfection ein zweifelhafter werden. Der Zeitpunkt aber, in welchem alle Luft entfernt ist, ist gar nicht ganz leicht festzustellen; es erfordert dies jedenfalls ein besonders geschultes Personal. Der zweite Grund, welcher der Einführung derartiger Apparate entgegensteht, ist der der Explosionsgefahr. Zur Aufstellung derselben bedarf es stets besonderer polizeilicher Genehmigung. Beide Punkte kommen nicht in Betracht bei den gebräuchlichen, mit ungespanntem Dampfe von 100"^ C. arbeitenden Desinfectionsapparaten. Jeder Damjjf- desinfectionsapparat sollte übrigens so constrairt sein, dass der Dampf an der obersten Stelle des Desinfectionsraumes in den letzteren ein- geleitet wird, und dass er an der untersten Stelle desselben wieder aus- tritt. Da der Dampf specifisch leichter ist als die atmosphärische Luft, so kommt nur bei dieser Anordnung eine möglichst schnelle Verdrängung der Luft durch den Dampf zu Stande. Man hat übrigens daran gedacht, inigespannten Wasserdampf von 100 Q, üijer stark erhitzte Metallflächen streichen zu lassen, um ihm dadurch eine höhere Temperatur zu verleihen,^ ohne dass dabei seine Spannung eine höhere würde. Solcher ungespamiter strömender über- hitzter Dampf verhält sich aber, vde Versuche von v. Esmarchi) gezeigt haben, in seiner keimtödtenden Kraft genau wie erhitzte trockene Luft, d. h. er ist für die Zwecke der Desinfection im Allgemeinen ebenso unbrauchbar wie heisse, trockene Luft. Die Gebrauchsgegenstände des täglichen Lebens, welche in den Desinfectionsanstalten mit strömendem Wasserdampfe behandelt werden, vertragen im Allgemeinen diese Procedur ausgezeichnet. Kleider, Wäsche, Betten, Bücher kommen aus dem Apparate unversehrt hervor. Sie trocknen an der Luft in kürzester Frist und sind dann wieder ge- Zeitsebrift f. Hygiene. Bd. :^. 188^ 30 A. Allgemeines. brauch sfäliig. ISTur Leder macht hierin eine Ausnahme. Leder wird durch die Dampfbehandhmg in eine starre, brüchige, absolut unbrauch- bare Masse verwandelt. Die im Vorhergehenden geschilderten Methoden der Desinfection durch höhere Temperaturen verwenden HitzegTade von 100^ C. oder darüber. Gelegentlich der Besprechung der Bereitung der bakterio- logischen Nährböden werden wir eine Methode kennen lernen, welche eine sichere Sterilisirung für gewisse Zwecke bei erheblich niediigeren Temperaturen (um c. 56^ C.) ermöglicht (cf. Sterilisirung des Blut- serums). An dieser Stelle sei das sogenannte Pasteurisiren erwähnt. Man versteht darunter eine, speciell für Milch (und Bier) angewendete, Methode des Haltbarermachens flüssiger Nahrungsmittel durch kurz- dauernde Erhitzung auf 70 — 75'' C. und nachfolgende Abkühlung. Selbstverständlich werden vorhandene Sporen durch das Pasteurisiren nicht beeinflusst. Ausser durch hohe Temperaturen kann nun eine Sterilisirung oder Desinficirung auch durch chemische Mittel bewirkt werden. Es giebt eine ganze Reihe von Körpern, welche, in flüssiger Form mit Bakterienkeimen kürzere oder längere Zeit in Berührung gebracht, die letzteren mehr oder weniger schädigen resp. tödten. Durch grund- legende Versuche R. Koch's^) wurde der Nachweis erbracht, dass solche Körper i n W a s s e r gelöst sein müssen, damit sie auf die Bakterienzelle einwirken können. Oelige oder alkoholische Lösungen haben eine desinflcirende oder keimtödtende Wirkung nicht. Koch fand, dass, wie dies für die Desinfection durch Hitze gilt, so auch einem jeden chemischen Desinfectionsmittel gegenüber sich Dauerformen und vegetative Formen dm-chaus verschieden verhalten. Die letzteren werden stets erheblich leichter vernichtet als die Sporen. Die vegetativen Formen der Bakterien haben im Allgemeinen die Eigenschaft, dass sie die völlige Wasserentziehung, das Austrocknen, nur kürzere Zeit ertragen. Ln Allgemeinen werden Bakteriem^mchs- formen durch wenige Tage langes Trockenliegen resp. durch wenige Tage lang andauernde Wasserentziehung getödtet. Einzelne Species sind ausserordentUch leicht durch Austrocknen zu vernichten. Hierhin gehört z. B. der Choleravibrio, Avelcher nach mehrstündigem (etwa dreistündigem) \m-klichem Austroclmen 2) nicht mehr keimfähig, d. h. 1) Mitth. a. d. Kais. Ges.-A. Bd. 1. ISSl. p. 250, 251. -) Ein wirkliches Austrocknen ist in kürzester Zeit nur dann zu erreichen, wenn die bacillenartige Flüssigkeit in dünnster Schicht angetrocknet wird (z. B. am Deckglase). IL Allgemeine Lebensbedingungen der Bakterien. 31 todt ist. Die Dauerformen der Bakterien hingegen werden, soweit unsere Erfahrungen reichen, durch auch noch so lange Wasserentziehung nicht beeinflusst. Die Kenntniss dieser Verhältnisse ist nothwendig, wenn man das Verhalten von bestimmten chemischen Mitteln Bakterien gegenüber zu prüfen hat. Als Koch^) z. B. die Einwirkung von 5proc. Carbolöl (Olivenöl) auf Milzbrandbacillen (nicht Sporen) studirte, fand er, dass die Bacillen nach sechstägigem Aufenthalte in dem Carbolöl todt waren. Genau dasselbe Resultat erhielt er mit 1 proc. Carbolöl, genau dasselbe auch mit reinem Olivenöl. Alle diese Körper wii'kten, ebenso wie eine 5 proc. alkoholische Carbolsäurelösung, auf Milzbrandsporen auch bei monatelanger Berührung nicht im mindesten ein.-) Früher schon hatte R. Koch^) nachgewiesen, dass in dünnen Schichten angetrocknete sporenfreie Milzbrandbacillen durch das Austrocknen in 12 — 30 Stunden ihre Keimfähigkeit verlieren. In den eben geschilderten Versuchen mit den öligen Flüssigkeiten haben die letzteren also nicht nm* nicht irgendwie die Tödtung der Bacillen beschleimigt , sondern sie haben , höchst wahrscheinlich sogar etwas conservirend auf die Bacillen gewii'kt, da dieselben sich erst nach sechs Tagen abgestorben zeigten. Es ist dies \ielleicht dadurch zu erklären, dass die öligen Flüssigkeiten das völlige Austrocknen etwas verzögerten. Die oben citirten Koch'schen Desinfectionsversuche haben eine Reihe von grundlegenden Daten festgestellt. Koch*) wies die völlige Unwirksamkeit von Alkohol, von Olycerin, Chloroform, Schwefelkohlenstoff, Benzol auf Milzbrandsporen nach. Er fand andererseits, dass frisch bereitetes Chlor wasser, Bromwasser (2:100), Jod wasser gute Desinficientia sind. Dieselben vernichteten Milzbrandsporen innerhalb eines Tages. Dasselbe that 1 proc. wässerige Osmiumsäurelösung sowie Iproc. wässerige Kaliumperman- ganatlösung. Terpentinöl brauchte fünf Tage, 5proc. wässerige Eisenchloridlösung sechs Tage, 2proc. wässerige Salzsäure- lösung zehn Tage, Aether dreissig Tage, um dieselbe Wirkung auszuüben. Besonders interessant waren die Ergebnisse für wässerige C a r b 1 s ä u r e 1 ö s u n g e n. Eine 1 proc. sowohl wie eine 2 proc. Lösung 1) Mitth. a. d. Kais. Ges.-Amte. Bd. 1. 1881. p. 251. 2) Wie Teu scher (Zeitschr. f. Hyg. Bd. 9, 1890. p. 510) gefunden hat, bleiben sehr widerstandsfähige Mlzbrandsporen in reinem crystalUsirten Phenol (Carbolsäure) , welches im Brütschrank flüssig gehalten wird, bis zu 4^/,> Tagen ent- wickelungsfähig. =) Cohn's Beitr. z. Biol. d. Pfl. Bd. 2. 187(3. p. 291. *) Mitth. a. d. Kais. Ges.-Amte. Bd. 1. 1881. p. 263 ff. 32 ^- Allgemeines. wirkten nicht mit Sicherheit auf Milzbrandsporen ; eine Sprue. l)raiichte sieben Tage, eine 4proc. drei Tage, eine 5proc. zwei Tage, mn Milz- brandsporen zu vernichten. Die letzteren Zahlen gelten jedoch nicht für Milzbrandsporen jedweder Provenienz. Nach den oben (p. 27) citirten Ermittelungen von E. v. Esmarch giebt es Milzbrandsporen, welche die Einwirkung 5proc. wässeriger Carbolsäurelösung länger als vierzig Tage ohne Schädigung ertragen. Als das mächtigste chemische Desinfectionsmittel ergab sich bei den Koch 'sehen Versuchen das Quecksilberchlorid (Sublimat). Durch eine ^/-^^proc. wässerige Lösung dieses Körpers zeigten sich Milzbrandsporen innerhalb weniger Minuten vernichtet. Die Milzbrand- sporen wurden bei diesen Versuchen , an kurzen S e i d e n f ä d e n angetrocknet, dem Desinfectionsmittel ausgesetzt. Nach gewisser Zeit wurden die Seidenfäden aus der Sublimatlösung herausgenommen, mit Wasser und (zur Entfernung der letzten Reste des in Wasser schwer löslichen Sublimats) mit Alkohol abgespült und dann zur Unter- suchung der Keimfähigkeit auf künstlichen Nährboden oder in den Körper eines für ]\Iilzbrand empfänglichen Versuchsthieres gebracht. Ein Ausbleiben der Entwickelung von Milzbrandbacillen in den Culturen resp. das dauernde Gesundbleiben des Thieres wurde als beweisend angesehen für die gelungene Sporenvemichtung. Später hat jedoch Geppert^) gezeigt, dass das Ausbleiben des Auskeimens und der weiteren Entwickelung der Milzbrandsporen unter den geschilderten Umständen nicht jedesmal mit Sicherheit als end- gültige Vernichtung der Sporen aufgefasst werden darf. Geppert wies nach, dass den Sporen, welche mit Sublimatlösung behandelt, mit Wasser und Alkohol abgespült sind, immer noch geringe Reste von Sublimat anhaften, und dass diese Reste es sind, welche die fernere Ent\nckelung der Sporen auf den geeignetsten Nährböden verhindern. Durch kürzere oder längere Behandlung der Sporen mit Schwefel- amnioniuni oder mit anderen Quecksilber ausfällenden Lösungen Hessen sich diese Sublimatreste aus den Sporen entfernen, und dann waren die Sporen wieder fähig, auf künstlichen Nährböden oder im Thierkörper auszukeimen, d. h. Culturen zu bilden resp. Lifection zu veranlassen. Die Versuche von Geppert haben gezeigt, dass im Durchschnitt eine 20 Stunden lange Einwirkung der ^loP^'^c Sublimatlösung auf die Milzbrandsporen erforderlich ist, um dieselben so weit zu schädigen, dass sie (nach erfolgter Ausfällung des Sublimats) keine Infection mehr ^) Berl. klin. AVocheiischr. 1SS9. No. 36, 37. — Deutsche med. Wochenschr. 1891. No. 37. n. Allgemeine Lebensbedingungen der Bakterien. 33 veranlassen. Die so geschädigten Sporen geben aber immer noch zu Cultiu-en auf künstlichem Nährboden Veranlassung. Erst nach drei Tage langer Beeinflussung der Sporen durch die Sublimatlösung erlischt die Fähigkeit der Auskeimung auf künstlichem Nährboden.^) Geppert stellte übrigens seine Versuche nicht mit Seidenfäden, an denen Sporen angetrocknet sind, an; diese Seidenfäden setzen dem Eindringen des Desinfectionsmittels immer einen gewissen Widerstand entgegen; er stellte sich vielmehr eine dünne Aufschwemmung isolirter Sporen in Wasser dar und schuf dadurch die denkbar günstigsten Bedingungen für die Einwirkung der Desinfectionsflüssigkeit auf die Sporen. Sublimatlüsungen sowohl wie Carbolsäurelösungen gewinnen durch Zusatz von Säuren ganz erheblich an keimtödtender Kraft. Ausser- dem hat der Zusatz von Säure (^/g ^Jq Salzsäure oder Weinsäure) zu Sublimatlüsungen noch den Vortheil, dass sich die letzteren selbst bei Benutzung gewöhnlichen Wassers dauernd unzersetzt halten, was ohne diesen Zusatz nur bei Anstellung der Flüssigkeit mit reinstem destil- lirtem Wasser und Aufbewahrung im Dunkeln der Fall ist. Statt der Säure kann auch Kochsalz als Zusatz genommen werden.-) Die sogenannte rohe Carb Ölsäure, ein in Wasser unlösliches Gemisch verschiedener Phenole, harziger Stoffe und anderer Körper, vermochte Laplace^) durch Vermischen mit roher Schwefelsäure in eine wasserlösliche Substanz („rohe Schwefelcarb Ölsäure") überzuführen, die sehr erhebliche desinficirende Eigenschaften hat. C. Fraenkel^) hat gefunden, dass diese Eigenschaften noch wesent- lich zunehmen, wenn die Mischung nicht, wie es Laplace that, bei höherer Temperatur, sondern im Gegentheil unter energischer Abküh- lung durch Eis, vorgenommen wird. In der resultirenden Flüssigkeit sind durch den Säurezusatz die höher (bei 185 — 205" C.) siedenden Homologen des Phenols, die Methylphenole oder Kresole, welche in der rohen Carbolsäure in unlösHchem Zustande vorhanden waren, wasserlöslich geworden; diese Körper, die Kresole, sind mit ganz hervorragenden keimtödtenden Eigenschaften ausgestattet. An dieser Stelle mag auch das englische (Pearson"sche, Jeyes'sche) Creolin erwähnt werden, welches ein Gemisch von Seife, Kohlenwasserstoffen, Pyridinen und Phenolen ist, und welches unter ^) Wie weit für dieses Stadium der Sporenschädigung „der bisher übliche Be- griff der Abtödtung" zutrifft, lässt Geppert dahingestellt. ^) cf. Angerer, Centr. f. Chir. 1887. Xo. 7. — Laplace, Deutsche med. Wochenschr. 1887. No. 40. — Michaelis, Zeitschrift für Hyg. Bd. 4. 1888. *) Deutsche med. Wochenschr. 1888. No. 7. ^) Zeitschr. f. Hyg. Bd. 6. 1889. Günther, Bakteriologie. 4. Auflage. 3 34 A. Allgemeines. Umständen, nämlich wenn es in eiweissfreien Lösungen auf Bakterien- keime einwirkt, ein vortreffliches Desinfectionsmittel ist (Behring).^) Das Lysol,") ein Präparat, welches wasserlöslich gemachte Kresole'^) enthält, ist dem Creolin an desinficirender Kraft noch überlegen (Schottelius*), Gerlach^j). Als brauchbares Desinfectionsmittel hat sich femer der A e t z k a 1 k herausgestellt: namentlich für Faeces, für Abortgruben verdient der- selbe Empfehlung (E. Pfuhl ^)). Für denselben Zweck ist auch das Saprol^), ein oeliges, auf Wasser schwimmendes, an Phenol mid Kresolen reiches Präparat, im Gebrauch. ^) Schimmelbusch erkannte in der kochenden Iproc. wäs- serigen Sodalüsung ein äusserst kräftig wirkendes Desinfections- mittel ; dasselbe zerstört sehr resistente Milzbrandsporen in 2 Minuten. ®) Gasförmige Desinfectionsmittel haben sich im All- gemeinen nicht als zuverlässig erwiesen. Ein wichtiger hierher ge- höriger Körper, auf den sich neuerdings die Aufmerksamkeit mehr gelenkt hat, ist der Forma Idehyd. Über seine bakterienschädigen- den Eigenschaften hat zuerst L o e w ^^) berichtet. Der Formaldehyd ist in etw^a 40proc. wässriger Lösung („Formal in ")^^) im Handel zu haben. Das Formalin wird (nach den Empfehlungen von Haus er [siehe hinten Abschnitt V, 3] ) in der bakteriologischen Praxis besonders zur Conservirung von Bakterienculturen verwendet. An dieser Stelle mag auch das Jodoform erwähnt sein. Dieser Körper verdankt die Bedeutung, welche er für die praktische Chirurgie hat, nicht bakterientödtenden Eigenschaften in dem gewöhnlichen Sinne. Das Jodoform entfaltet nur dann antiseptische Wirksamkeit, wenn es zersetzt wird; dies geschieht z. B. , wenn das Jodoform in inficii'te ^) Deutsche militärärztl. Zeitschr. IS 88. Xo. 8. ^) Erzeuger : S c b ii 1 k e & M a y r , Hamburg. ^) Das Verfabren der Darstellung stebt unter Patentschutz. *) Müncb. med. Wochenschr. 1890. No. 19, 20. ") Zeitschr. f. Hyg. Bd. 10. 1891. «) Zeitschr. f. Hyg. Bd. 6 und 7. 1889; Deutsche med. Wochenschr. 1892. p. 879. ') Erzeuger: Dr. H. Xördlinger in Bockenheim bei Frankfurt a. M. «) cf. Laser, Centralbl. f. Bakt. Bd. 12. 1892. p. 229; A. Pfuhl, Zeitschr. f. Hyg. Bd. 15. 1893. p. 192. ö) Arb. a. d. chir. Klin. d. K. Univ. Berbn. b. Theil. 1891. p. 78. 1*») Ges. f. Morph, u. Phys. zu München. 1. Mai 1888; offic. Protokoll Müncb. med. Wochenschr. 1888. p. 412. ^^) cf. Prosi^ect der „Chem. Fabr. auf Actien (vorm. E. Schering)" vom März 1893. II. Allgemeine Lebensbedingungen der Bakterien. 35 Wunden gebracht wird. Mit den Stoffwechselproducten der Bakterien geht das Jodoform wechselseitige Zersetzungen ein, wodurch antiseptisch Avirkende, lösliche Jodverbindungen entstehen (Behring^)). Wenn vni hier die wichtigsten chemischen keimtödtenden Mttel kurz betrachtet haben, so wollen wir andererseits darauf verzichten, die vielerlei anderen chemischen Körper, welche auf ihre keimtödtenden Eigenschaften untersucht worden sind , zu berühren. - ) Es sei aber auf eine Eeihe wichtiger principieller Punkte hingewiesen, die bei Prüfung chemischer Körper auf ihre desinficirenden (b a k t e r i e n s c h ä d i g e n d e n ) Wirkungen zu beachten sind. ^) Zu- nächst kommt es sehr an auf die chemische Beschaffenheit des Desmfectionsobjectes, d. h. des Mediums, in welchem das Mittel auf die Bakterien einwirkt. Wie Behring fand, werden z. B. Milz- brandbacillen, die in Wasser vertheilt sind, schon in wenigen Minuten durch einen Subhmatgehalt von 1 : 500 000 sicher getödtet, in Bouillon erst durch einen Gehalt von 1:40 000, während in Blutserum, wenn die Desinfection in wenigen ]\Iinuten erfolgen soll, ein Sublimatgehalt von 1:2000 noch nicht immer ausreicht. Boer^j fand, dass bei ein- zelnen Bakterienarten die Widerstandsfähigkeit gegen Desinfections- mittel eine verschiedene ist je nach der chemischen Eeaction des Mediiuns, in welchem sie sich befinden. Ferner gilt der Desinfec- tionswerth, den ein bestimmtes Mittel der einen Bakterienart gegen- über besitzt, durchaus nicht ohne Weiteres für das Verhalten des Mittels gegen jede beliebige andere Bakterienart. Femer kommt es, wie das bereits aus den oben (p. 31 j cith-ten Koch'schen Desinfec- tionsuntersuchungen hervorgeht, an auf die Dauer der Einwirkung des Desinfectionsmittels. Je kürzere Zeit ein Mittel eimvirkt, in desto stärkerer Lösung muss es vorhanden sein, damit derselbe Effect er- zielt wird. Ein weiterer, ausserordentlich wichtiger Punkt ist, -wie A. H e n 1 e ^) gefunden hat , die T e m p e r a t u r , bei welcher das Des- inüciens einwirkt. Je höher die Temperatur, um so energischer der 1) cf. Behring, Deutsche med. Wochenschr. 1SS2. p. 147; 1887, p. 422. ^) Eine ausführliche Darstellung des derzeitigen Standes der Frage der Des- infection durch chemische Älittel findet man bei Behring (Zeitschr. f. Hyg. Bd. 9. 1890), ferner in dem Buche „Bekämpfung der Infectionskrankheiten. Infection und Desinfection. Leipzig (G. Thieme) 1894" desselben Autors. •^) In den nachfolgenden Zeilen lehne ich mich an die eben citirten Arbeiten Behring's an. — Bezüglich des praktischen Vorgehens bei Desinfec- tionsprüfungen siehe p. 36, Anm. 6. *) Zeitschr. f. Hyg. Bd. 9. 1890. •') Arch. f. Hyg. Bd. 9. 1889. 3* 36 -Ä- Allgemeines. Desinfectionseffect. ' ) Auch kommt es , wie zuerst (unabhängig von einander) Buchner-) und Nissen'^) betont haben, auf die Zahl der Bakterienzellen an, welche im gegebenen Falle abzutödten sind. Eine grössere Anzahl erfordert eine grössere Menge des Mttels. Ferner muss man die Prüfung auf die eventuell erfolgte Ab- tödtung der Bakterien, oder, was dasselbe ist, die Prüfmig, ob ihre Keimfähigkeit erhalten geblieben ist, einwandsfi'ei einrichten. Es kommt vor, dass Bakterien, die der Einwirkung eines Mittels unter- worfen wurden, bei der nachfolgenden Prüfung ihrer Entwickelungs- fähigkeit, wenn dieselbe bei einer der Art weniger zusagenden Temperatur vorgenommen wird, nicht wachsen, während sie dagegen sofort sich weiter entwickeln, wenn sie in möglichst günstige Temperaturverhält- nisse gebracht werden. Man muss deshalb die Prüfung stets bei dem Temperaturoptimum der zu dem Versuche benutzten Bakterienart anstellen. Endlich hat Gruber^) darauf aufmerksam gemacht, dass (da nach der Ein^virkung des Desinfectionsmittels die Auskeimung häufig verlangsamt istj es nothwendig ist, die B e o b a c h t u n g s z e i t bei der Prüfimg der event. erhaltenen Keimfähigkeit möglichst lange auszu dehne n.'^) ^) 1) Heider (Centralbl. f. Batt. Bd. 9. 1891. p. 221 und ArcL. f. Hyg. Bd. 15. 1892) theilt mit, dass JMilzbrandsporen , die durch 36tägige Einwirkung von 5proc. Carbolwasser bei Zimmertemperatur nicht vernichtet wurden, bei 55*^0. in 1 — 2 Stunden durch dasselbe Desinfectionsmittel zerstört wurden. Bei 75" C. waren 3 Minuten erforderhch ; 3 proc. Carbolwasser tödtete dieselben Sporen bei dieser Temperatur in 15 Minuten, Iproc. Carbolwasser in 2 — 2^1^ Stunden. — Nocht (citirt nach Behring, Zeitschr. f. Hyg. Bd. 9. 1890. p. 448 und „Bekämpfung der Infectionskrankheiten. Infection und Desinfection. Leipzig (G. Thieme) 1894." p. 120) fand, dass eine bestimmte Sorte von Milzbrandsporeu bei 37,5** C. abgetödtet wurde durch 5 proc Carbolwasser in 3 Stunden, durch 4 proc. in 4 Stunden, durch 3 proc. in 24 Stunden, während durch 2 proc. Carbolwasser bei 37,5** C eine Ab- tödtung nicht erfolgte. — Für Seifenlösungen hat J oll es (Zeitschr. f. Hyg. Bd. 19. 1895. p. 136 und 138) festgestellt, dass sie (auf Typhusbaeillen und Bact. coH commune) bei 4 — 8** C. bedeutend stärker abtödtend wirken als bei 18** resp. 30" C. Hier ist also der Desinfectionseffect bei der niedrigeren Temperatur grösser als bei der höheren. •-) Centralbl. f. Bakt. Bd. 6. 1889. p. 10. ») Zeitschr. f. Hyg. Bd. 6. 1889. p. 495. ') 7. int. Congr. f. Hyg. u. Demogr. London 1891. — Centralbl. f. Bakt. Bd. 11. p. 116. ■^) So sah Grub er Milzbrandsporen, die 24 Stunden in ^I^qI^toc. Sublimat- lösung gelegen hatten, manchmal erst nach 7 Tagen auskeimen, obwohl sie im Uebrigen weiter nicht geschädigt und insbesondere noch voUvirulent waren. **) Liegt in der Praxis die Aufgabe vor, eine chemische Substanz resp. deren Lösung auf ihre desinficirenden Eigenschaften zu prüfen, so II. Allgemeine Lebensbedingungen der Bakterien. 37 Es sei noch auf eine interessante allgemeine Beziehung hin- gewiesen, die zwischen der Giftigkeit chemischer Körper für Bakterien und ihrer Giftigkeit für den thierischen Organismus zu hestehen scheint. Behring^) fand für eine ganze Anzahl von hakterienschädigenden (antiseptischen) Stoffen, dass die tödtliche Dosis derselben für ein Kilo Kaninchen oder Maus ziemlich genau ein Sechstel beträgt von derjenigen Dosis, welche in einem Kilo Blutserum das Wachsthum verfährt man zu diesem Zwecke im Allgemeinen so, dass man znnäcbst die Einwirkung dieser Substanz auf Milzbrandsporen untersucht. Man stellt sich eine sporen- haltige Milzbrandcultur dar (siehe hinten unter Milzbrandbacillus) , mit der man in folgender Weise verfahrt: Nach dem Vorgange von Koch (cf oben p. 32) tränkt man kurze (etwa l^/.j cm lange) Seiden fäden, die man zunächst durch stunden- lange Erhitzung im Dampftopf sicher sterilisirt hat, mit einer Aufschwemmung der Milzbrandsporen in (durch längeres Auskochen) sterihsirtem Wasser. Nachdem die Fäden dann aus der Sporensuspeusion entfernt sind, lässt man sie (unter Vermeidung von Verunreinigungen) trocknen. Es kommt nun zunächst darauf an, die Eesistenz des verwendeten Sporenmaterials (cf oben p. 27) gegen Beeinflussung mit bekannten Desinfectionsmitteln, nämlich Wasserdampf von lOO'^C. und (bei Zimmertemperatur einwirkendem) 5proc. Carbolwasser, kennen zu lernen: Man hängt eine Reihe von Fäden — einzeln in kleine, aus (im Dampf) sterihsirtem Fliesspapier gebildete, Packetchen eingeschlagen — in den Dampftopf hinein, nimmt dann Minute für Minute je einen Faden heraus, um ihn — mit Hülfe einer durch Ausglühen sterilisirten Pincette — in je em Reagenzglas mit Nährbouillon einzutragen, das in den Brütschrank gestellt wird. Man erfährt auf diese Weise weiterhin, an welchen von den Fäden die anhaftenden Milzbrandsporen abgetödtet sind, an welchen nicht; man weiss dann ohne Weiteres, wieviel IVIinuten der Beeinflussung durch den strömenden Wasserdampf nothwendig sind, um die verwendeten Sporen zu tödten. In ähnlicher Weise geht man auch bei der Bestimmung der Resistenz gegen das 5proc. Carbolwasser vor. Nur wird man hier nicht Minute für Minute, sondern immer in Zwischenräumen von mehreren Tagen je einen Sporenfaden aus der Carbol- lösung nehmen (Einschlagen in Papiersäckchen ist hier selbstverständlich nicht noth- wendig), der dann zunächst in sterilisirtem Wasser abgespült und hinterher in Nähr- bouillon gebracht wird. Hat man sich so eine Anschauung von der Resistenz seines Sporenmaterials verschafft, so kann man nun Seidenfäden, welche mit gleichwerthigem Sporenmaterial getränkt sind, verwenden, um die Wirkung der zu prüfenden chemischen Substanz auf dieses Material festzustellen ; man bekommt auf diese Weise Aufschluss darüber, wie sich die Wirkung der zu prüfenden Substanz resp. einer bestimmten Lösung derselben im Vergleich zu der Wirkung des strömenden Dampfes resp. des 5proc. Carbolwassers stellt. — Häufig wird es gar nicht darauf ankommen, dass ein so resistentes Material, wie es Milzbrandsporen sind, durch ein bestimmtes Desinfec- tionsmittel vernichtet wird. Dies wird z. B. der Fall sein, wenn das Mittel speciell für die Desinfection von Choleraausleerungen etc. gebraucht werden soll. In solchem FaUe nimmt man als Testmaterial keine JMilzbrandsporen , sondern anderes, dem jeweihgen Falle entsprechendes Bakterienraaterial , welches man in zweckmässiger, ebenfalls dem specieUen Falle angepasster Weise mit der zu prüfenden chemischen Substanz in Berührung bringt. ') cf Zeitschr. f Hyg. Bd. 6. 1SS9. p. 475 ff. 38 A. Allgemeiues. der ]\Iilzbranclbacillen verhindert. Behring nennt diese Beziehimg die „relative Giftigkeit" und sagt: die relative Giftigkeit von Carbolsäure, Sublimat, Jodtrichlorid, Creoün u. s. w. ist gleich 6. Für den thierischen Organismns nngiftige Antiseptica werden sich wohl kaum auffinden lassen. Allgemein bekannt ist die grosse Bedeutung, welche die Verhält- nisse, die bei der künsthchen Vernichtung der Bakterien, speciell der Vernichtung durch chemische Mittel, in Frage kommen, für die operative Medicin, für Chirurgie und Geburtshülfe haben. Der moderne Chirurg kommt relativ seltener in die Lage , antiseptisch vorgehen zu müssen; dagegen ist es stets seine erste Sorge, „aseptisch" zu arbeiten, d. h. mit keimfreien Fingern, keimfreien Instrumenten, keim- freien Verbandstoffen zu operiren. Fürbringer.^) welcher sich bemüht hat, ein möglichst sicheres Verfahren zur Desinfection der Hände zu finden, wendet nach einander, je eine ]Vlinute lang, an: Seife mit Bürste und warmem Wasser, Alkohol (mindestens 80 procentig), 2promill. Sublimatlösung. Diese Methode hat bereits eine grosse Verbreitung gefunden. — Die Verbandstoffe werden jetzt meist im strömenden Wasserdampfe sterilisirt und in dadurch geschaffenem keimfi-eien Zu- stande ohne Zusatz antiseptischer Substanzen verwendet. Zur Sterili- sirung chirurgischer Metallinstrumente verfährt man nach Ermittelungen von Schimmelbusch-) am besten so, dass die In- strumente zunächst mechanisch sorgfältig gesäubert, dann in 1 proc. wässeriger Sodalösung (cf oben p. 34) 5 Mnuten lang gekocht werden. Die so sicher sterihsirten Instrumente werden bis zum Gebrauch in eine wässerige Lösung gelegt, die l ^/^ Soda und 1 ^/^ Carbolsäure enthält. Am Schlüsse dieses Kapitels wollen wir noch auf die mächtigen Wirkungen hinweisen, die dem Lichte'^) den Bakterien gegenüber zukommen (cf. p. 20). Durch directes Sonnenlicht werden ]Milz- brandsporen in Bouillon binnen wenigen Stunden vernichtet (Arloing).^) Aber auch das zerstreute Tageslicht hat deutlich bakterien- schädigende Eigenschaften. Cultaren der Tuberkelbacillen sterben, wenn sie dicht am Fenster aufgestellt sind, in 5 — 7 Tagen ab (Koch). •'^j ^) Untersuchungen und Vorschriften über die Desinfection der Hände des Arztes etc. Wiesbaden. 1888. 2) Arbeiten a. d. chir. Klinik d. K. Univ. Berhn. 5. Theü. 1S91. p. 46 ff. ^) Die Literatur über diesen Gegenstand findet man bei Kaum (Zeitschr. f. Hyg. Bd. 6. 1889), bei Janowski (Centralbl. f. Bakt. Bd. 8. 1890. p. IGT ff.), ferner bei Dieudonne (Arb. a. d. Kais. Ges.-A. Bd. 9. 1894. p. 412). *) Arch. de phys. norm, et pathol. t. 7. 1886. °) 10. internat. med. Congress. Berlin, 1890; Verhandlungen Bd. 1. p. 42. II. Allgemeine Lebensbedingungen der Bakterien. 39 Unter den das weisse Licht zusammensetzenden Strahlen scheinen be- sonders den blauen und violetten, d. h. den stärker brechbaren Strahlen, bakterienschädigende Eigenschaften zuzukommen. Die Thatsache wurde bereits (1877) von Down es und Blunt,^) welche die erste Ent- deckung bezüglich der bakterienschädigenden Wirkung des Lichtes machten, ermittelt. Ebenso erkannten diese Autoren bereits die grosse Bedeutung, welche der freie Sauerstoff bei der Belichtung des Bakterienmaterials hat. Ohne die Gegenwart freien Sauerstoffs scheint Bakterienschädigung durch Licht nicht einzutreten. Durch Richard- son^) sowie durch Dieudonne.-") ist später festgestellt worden, dass die Belichtung von bakterienhaltigen Flüssigkeiten resp. Culturen bei Sauerstoffanwesenheit die Production von Wasserstoffsuperoxyd veranlasst, welches seinerseits als kräftiges Desinfectionsmittel die Bak- terienschädigung bewirkt. Santori**) sowie Kruse '^) stellten fest, dass die bakterienschädigende Wirkung des Lichtes um so grösser ist, je höher die begleitende Temperatur. Eine einfache Methode, den schädigenden Einfluss des Lichtes zu demonstriren (theilweise Belich- tung dichtbesäeter Agarplatten vor der Auskeimung) hat H. B u c h n e r *^) beschrieben. In den letzten Jahren ist auch mehrfach über bakterienschädigende Wirkungen der Electricität berichtet worden. ' ) Selbstverständlich hat man bei der Beurtlieilung solcher Wirkungen auf die rein chemische Wirkung eventuell durch Electrolyse gebildeter Körper stets Rücksicht zu nehmen. ') Proceed. of the Royal Soc. of London, vol. 2(i. '-) Journ. ehem. Soc. 1893. 1. 1109—1130; ref. Ber. d. Deutsch. Chem. Ges. 26. Jahrg. Bd. 4. p. 823. ") Arb. a. d. Kais. Ges.-A. Bd. 9. 1894. *) cf. Centralbl. f. Bakt. Bd. 8. 1890. p. 738. '') Zeitschr. f. Hyg. Bd. 19. 1895. p. 324. «) Centralbl. f. Bakt. Bd. 12. 1892. No. 7/8; Arch. f. Hyg. Bd. 17. 1893. ') Die Literatur über diesen Gegenstand siehe bei Spilker und Gottstein (Centralbl. f. Bakt. Bd. 9. 1891. No. 3/4) sowie bei S. Krüger (Zeitschr. f. klin. Med. Bd. 22. 1893). III. Allgemeine Lebensäusserungen der Bakterien. IJei dem Wachsthuni und der Vermehrung der Bakterien treten eine gTosse Eeihe Aon Erscheinnngen zu Tage, die in letzter Linie meist darauf zurückzuführen sind, dass durch den Lebensprocess der Bakterien die complicirten Verbindungen, aus denen der Nährboden zusammengesetzt ist, in einfachere übergeführt werden. So wie aber eine jede einzelne Art ihre eigenen specifischen Lebensbedingungen hat, so sind auch die Processe, welche mit dem Bakterienwachsthum verknüpft sind, und die Erscheinungen, welche durch dasselbe ver- anlasst werden , die L e b e n s ä u s s e r u n g e n , für die einzelnen Arten verschieden. Was die chemischen Processe betrifft, die bei dem Wachs- thum der Bakterien in die Erscheinung treten, so können hierbei (als Stoffwechselproducte) die einfachsten chemischen Verbindungen gebildet werden: Kohlensäure, Wasserstoff, Methan, Schwefelwasserstoff,^) ^) Nach Untersuchungen von Petri und Maassen (Centralbl. f. Bakt. Bd. 11. 1892. No. 9/10; Arb. a. d. Kais. Ges.-Amte. Bd. 8. 1893. p. 326, 338 ff.) sowie nach Untersuchungen von Stagnitta-Balistreri, die im Eubner 'sehen Institut ausgeführt wurden (Arch. f. Hyg. Bd. 16. 1892), ist die Schwefelwasser- stoffbildung eine weit verbreitete Eigenschaft der Bakterien. Stagnitta con- statirte, dass die Zusammensetzung des Nährbodens von wesentHcher Bedeutung bezüghch des Zustandekommens der Schwefelwasserstoffbildung und bezüglich der Quantität des gebildeten Schwefelwasserstoffs ist. Eubner (Arch. f. Hyg. Bd. 16. 1892) hat nachgewiesen, dass der zur Bildung des Schwefelwasserstoffs noth wendige Schwefel ganz allgemein aus organischen Schwefelverbindungen des Nähr- bodens entnommen wird. — Der Nachweis der Schwefelwasserstoffbildung bei Bak- terienculturen wird sehr bequem durch Einhängung eines mit Bleizuckerlösung getränkten Fliesspapierstreifchens in das Culturgefäss geführt. Bei Schwefelwasser- stoffentwickelung tritt Schwärzung (Bildung von Schwefelblei) ein (cf. Schrank, Wien. med. Jahrbücher. 1888. p. 313). Auch kann die Schwefelwasserstoffbildung dadurch nachgewiesen werden , dass man bei dem Anstellen der Cultur das untere Ende des die Cultur verschliessenden Wattepfi'opfs mit Bleizuckerlösung tränkt. Fromme (Diss. Marburg 1891. — Eef. Centralbl. f. Bakt. Bd. 12. p. 274) stellt III. Allgemeine Lebensäusseriuigen der Bakterien. 41 Ammoniak u. dgi. Ferner kommt es bei den Zersetzmigen des Nähr- bodens zm- Bildung der verschiedenartigsten Fermente^) oder Enzyme. So giebt es Bakterienarten, welche dia statische Fermente bilden (d. h. solche, die Stärke in Tranbenzucker umwandeln); andere bilden invertirende Fermente (Umwandlung von Rohrzucker in Trauben- zucker) ; andere Bakterienarten bilden j) e p t o n i si r e n d e Fermente, d. h, solche, die geronnenes Eiweiss, erstarrte Gelatine lösen (peptonisiren); andere Bakterien bringen durch Production von Labferment Mich zur Gerinnung (Ausfällung des Caseins). Ferner werden durch Bakterien die verschiedenartigsten Gäh- rungen^) zu Stande gebracht. Unter Gährung versteht man die Zerlegung organischen Materials unter Gasentwickelung.-') Eine Anzahl von Arten vergährt Zucker"') unter Bildung von Milch säur e'^j (Milch- säur e g ä h r ü n g) ; andere vergähren Stärke und Zucker unter Bildung von B u 1 1 e r s ä u r e (B u 1 1 e r s ä u r e g ä h r u n g) ; l)ei den beiden Arten der Gährung wird zugleich Kohlensäure, bei der Buttersäuregährung ausserdem Wasserstoff gebildet. Weitere Arten der Gährung sind die besonders in Wein auftretende schleimige oder M a n n i t g ä h r u n g, welche durch Bildung einer fadenziehenden, schleimigen Gummiart und von Mannit imd Kohlensäure aus Traubenzucker characterisirt ist; sich behufs des Schwefelwasserstoffnaehweises eine Eisengelatine her (Zusatz von 3**/o Eisentartarat oder Eisensaccharat zu Nährgelatine). Dieser Xährboden zeigt durch Schwarzfarbung (Bildung von Schwefeleisen) Schwefelwasserstoffbildung an. — Neben der Schwefelwasserstoffbildung ist auch die Production von (Methyl-) Mer- captan eine weit verbreitete Eigenschaft der Bakterien (Nencki und Sie her, Monh. f. Chemie. Bd. 10. 18S9. p. 526 ff.; Eubner, Arch. f. Hyg. Bd. 19. 1893. p. 184; Pe'tri und Maassen, Arb. a. d. Kais. Ges.-A. Bd. 8. 1893. p. 498). ^) cf. Flügge, Die Mikroorganismen. 2. Aufl. Leipzig 1886. p. 466 ff. -) cf. Flügge, 1. c. p. 483 ff. ^) Dies ist die Definition der Gährung im engeren Sinne. Man fasst jedoch den Begriff der Gähi-ung heutzutage vielfach etwas weiter und versteht auch solche Zerlegungen darunter, bei denen Gasentwickelung fehlt. ■*) Verschiedene Zuckerarten verhalten sich gegenüber den Bakterien verschieden. Es giebt zahlreiche Bakterienarten, welche zwar Traubenzucker (Dextrose, Glycose), aber nicht Milchzucker anzugreifen vermögen, während es wiederum andere Ai'ten giebt, die sowohl Traubenzucker wie Milchzucker vergähren, ^) Nencki (Centralbl. f. Bakt. Bd. 9. 1891. p. 304) hat darauf aufmerk- sam gemacht, dass von differenten Bakterienarten differente (isomere) Milchsäuren gebildet werden können, und dass die durch diese Isomerien bedingten physikalischen und chemischen Unterschiede unter Umständen zur Differentialdiagnose einander ähn- licher Spaltpilzarten benutzt werden können. — Pere (Ann. de Tlnst. Pasteur 1893. p. 739, 740) fand, dass die Ai-t der gebildeten IVIilchsäure bei einer und derselben Bakterienart und bei einer und derselben Zuckerart verschieden sein kann je nach der verschiedenen Stickstoffnahrung, die den Bakterien geboten wird. 42 -^- Allgemeines. ferner die Essiggährung (Verwandlung des Aethylalkohols durch Oxydation in Essigsäure). Eeraer ist hier zu nennen die ammonia- kalische Harnsto f f g ä h r u n g (Spaltung des Harnstoffs in Kohlen- säure und Ammoniak). Zu den Gährungen gehören auch die verschiedenartigen Fäul- nis s p r o c e s s e /) d. h. die Zersetzungen stickstoffhaltiger organischer Massen unter Enthindung stinkender Producte (Eiweissgährung). Im Allgemeinen hat man zwei verschiedene Arten der Zersetzung der complicirten stickstoffhaltigen organischen Verbindungen, der Eiweiss- stoffe, durch Bakterien zu unterscheiden. Die eine ist die F ä u 1 n i s s , die andere die Verwesung. Die Fäulnis s (unter der wir, wie eben gesagt, die Zersetzung des Eiweissmoleküls unter Auftreten stin- kender Producte verstehen) findet fast immer unter Abschluss von Sauerstoff^) statt. Sie wird bedingt durch den Lebeusprocess anaerober Bakterien ; sie stellt einen R e d u c t i o n s p r o c e s s ^j dar. Im Gegensatz dazu bildet die Verwesung einen Oxydations- pro c e s s ; ^) sie findet statt unter der Mitwirkung von atmosphärischem Sauerstoff. Die Fäuluissprocesse gehen selbstverständlich um so schneller vor sich, je günstiger che Temperaturverhältnisse für das Wachsthum der betheiligten Bakterien hegen. Mau kann deshalb Objecte (Fleisch etc.), welche leicht in faulige Zersetzung tibergehen, durch Halten bei niedriger Temperatur einigermassen conserviren. Dass aber selbst bei 0*^ C. Fäulniss stattfindet (wenn auch relativ langsam) hat Forst er, dem wir (cf. oben p. 23 j die Entdeckung bei 0" wachsender Bakterienarten verdanken, nachgewiesen.'^) Bei der Fäulniss werden nie so einfache Verbindungen gebildet wie bei der Verwesung, aus der schliesslich die allereinfachsten anorga- nischen Verbindungen, Mtrate, Sulfate, Kohlensäure, hervorgehen. ^) cf. Flügge, 1. c. p. 493 S. -} In Ausnahmefcällen können auch bei Sauerstoffanwesenheit stin- kende Producte bei der Zerlegung der Eiweisskörper durch Bakterien entstehen. '^) Nach Behring sind mit der stinkenden Fäulniss regelmässig energische Eeductionsprocesse verbunden. (Zeitschr. f. Hyg. Bd. 7. 1889. p. 185.) ■*) Bei der Verwesung beerdigter Körpertheile im Boden kommt es zu erheb- lichen Temperatursteigerungen im Innern der verwesenden (resp. faulenden) Organe, die besonders dann beträchtlich werden, wenn es sich um Organe handelt, die von (gewissen) Infectionskrankheiten herstammen, (cf. Schottelius, Centralbl. f. Bakt. Bd. 7. 1890. No. 9; Karlinski, ebenda Bd. 9. 1S91. No. 13.) ^) Centralbl. f. Bakt. Bd. 12. 1892. p. 434. — In Fleischbrei, welcher bei 0" C. gehalten wurde, fand Forster nach 16 Tagen (neben unzähligen Bakterien) etwa ebensoviel Zersetzungsproducte wie in dem gleichen Fleische, welches 6 — 7 Tage bei 7 — 9** C. oder 2 Tage bei Zimmertemperatur gehalten worden war. III. Allgemeine Lebensäusserungen der Bakterien. 43 Pa stein-, welcher diese Vorgänge bekanntlich zum Gegenstande umfassender, grundlegender Untersuchnngen gemacht hat, hat dadiu'ch zuerst Aufklärung gegel)en über die wichtige allgemeine Rolle, die den Bakterien in dem Haushalte der Natur zugewiesen ist. Das organische Leben producirt fortlaufend Massen von complicirten stickstoffhaltigen Verbindungen. Den Bakterien fällt die Aufgabe zu, diese complicirten Verbindungen in. einfachere, in einfachste, anorganische, für die höhere Pflanzenwelt assimilii-bare Verbindungen überzuführen ; die Pflanzenwelt sorgt dann ihrerseits im Verein mit der Thierwelt wieder für den Aufbau des complicirt zusammengesetzten Eiweissmoleküls aus diesen einfachsten Verbindungen. So dienen die Bakterien als Vermittler organischen Sterbens und Lebens; durch ihre Mtwh'kung wird es ermöglicht, dass die organische Welt im Gleichgewichte bleibt. Von ganz besonderer Bedeutung sind die geschilderten Verhältnisse für die L an dwirth schaff. Wenn das Feld gedüngt ist, so müssen die complicirten organischen Verbindungen, welche der Dünger enthält, zunächst durch einen durch Bakterien bedingten Verwesungsvorgang in die einfachsten, für die Pflanzen assimilirbaren Verbindungen über- geführt werden. Dies kann, wie erörtert, nur unter Sauerstoffzutritt geschehen; und es ist deshalb eine Auflockerung des Erdreiches resp. eme grobporige Bodenbeschaffenheit erforderlich, damit nicht nur an der Oberfläche des Bodens, sondern auch mehr m die Tiefe hinein der Sauerstoff Zutritt hat. Em gewisser Wassergehalt des Bodens ist zum Zustandekommen der Verwesungsprocesse natürhch erforderlich; denn ohne Wasser können Bakterien nicht wachsen ; ein zu grosser AVasser- gehalt aber würde die Bodenporen verschliessen und die Entstehung von Fäulniss im Boden bedingen. M Der wichtigste Theil des Ver- wesungsvorganges im Boden wd durch die sogenannte „Nitrification"-) dargestellt. Man versteht darunter die Oxydirung des (organischen) Stickstoffs resp. Ammoniaks zu Salpetersäure. Schlösing und Müntz wiesen (1877) zuerst nach, dass die Nitrification im Boden von der Lebensthätigkeit organischer Wesen abhängig ist. Nach Winogradsky") setzt sich der Nitrificationsprocess aus zwei verschiedenen Perioden zu- sammen, nämlich 1) der Periode der Nitritbildung und 2) der der Nitrat- bildung. Jede Periode spielt sich ab unter dem Einflüsse specifischer, für die beiden Perioden verschiedener, organisirter Fermente (Bakterien). ^) pf. E. Wollny, Ueber die Beziehungen der Miki-oorganismen zur Agricultur. Centralbl. f. Bakt. Bd. 1. 1887. No. 15— IG. -) Vergl. hierüber auch das Sammelreferat von Burri (Centralbl. f. Bakt. 2. Abth. Bd. 1. 1895. p. 22 ff.). ä) Ann. de Tlnst. Pasteur. 1891. p. 599. 44 A. Allgemeines. Die Entwickelimg und Wirkung der Mtritl)ildner (ferments nitreux) ist auf Gegenwart von Ammoniak angewiesen: diese Organismen oxj'^diren das Ammoniak zu Nitrit. Die Nitratbildner (ferments nitriques) können in Gegenwart von Ammoniak nicht existiren; sie oxjdiren Nitrite zu Nitraten.^) Auf der anderen Seite kommen in der Natur auch in weiter Ver- breitung Bakterienarten vor, welche Nitrate zu reduciren vermögen. 2) lieber ein in der Natur weit verbreitetes „Sulfidferment", eine Bakte- rienart, welche die Fähigkeit hat, Sulfate zu reduciren, hat jüngst B e y e r i n c k ■='j berichtet. Unter den bei dem Wachsthum von Bakterien gebildeten Stofl- wechselproducten nehmen einzelne, chemisch leicht nachweisbare, Körper wegen des Umstandes, dass sie von manchen Arten gebildet werden, von anderen nicht, in Bezug auf die Differentialdiagnose der Bakterien- arten eine wichtige Stellung ein. Hierher gehört z. B. das Indol,*) ein Product der Eiweisszersetzung. Die chemische Keaction des Nährbodens vdid durch Bakte- rienwachsthum fast stets geändert. Man kann danach die Bakterien in solche eintheilen, Avelche Säuren, und in solche, welche Alkalien produciren.'^j ^) Die künstliche Reinzüchtung der „Nitro bakterien" gelingt nach W i n o - gradsky (Ann. de l'Inst. Pasteur. 1891. No. 2) auf einem festen Nährboden, welcher aus einer Lösung von Wasserglas (Natriumsilicat) unter Zusatz verschiedener Salze hergestellt wird. — Die Kieselsäure als Nährboden für Mikroorganismen wurde zuerst von W. Kühne (Zeitschr. f. Biol. Bd. 27. 1890) angegeben. Siehe über die Bereitung derartiger Nährböden auch Sleskin (Centralbl. f. Bakt. Bd. 10. 1891. No. 7). -) Eine einfache Methode, Salpeter reducirende Arten zu isoliren, hat neuer- dings Beyerinck (Centralbl. f. Bakt. 2. Abth. Bd. 1. 1895. p. 58. Anm. 2) angegeben. Vgl. über nitratreducirende Bakterien auch die Arbeit von Burri und Stutzer (Centralbl. f. Bakt. 2. Abth. Bd. 1. 1895. No. 7—12). 3) Centralbl. f. Bakt. 2. Abth. Bd. 1. 1895. No. 1—3. — Diese Art, „Spirillum desulfuricans", ist in Grabenschlamm stets zu finden; sie gedeiht am besten bei etwa 25*^ C, wächst nur unter absolutem Abschluss des Sauerstoffs (cf. oben p. 22. Anm. 1). "*) Kitasato (Zeitschr. f. Uyg. Bd. 7. 1889. p. 519), ferner Lewandowsky (Deutsche med. Wochenschr. 1890. p. 1186) haben eine Reihe der wichtigsten Bak- terienarten auf ihre Fähigkeit, ludol (resp. Phenol) zu bilden, geprüft. •') cf. J. Petruschky, Bakterie -chemische Untersuchungen. (Centralbl. f. Bakt. Bd. 6. 1889. No. 2.3—24, Bd. 7. 1890. No. 1—2.) Der Autor stellte seine Untersuchungen an einer neutralen Lackmusmolke (mit Lackmus gefärbtes Milch- serum) an. (Der Lackmuszusatz zu bakteriologischen Nährböden behufs Erkeimung der Aenderung der chemischen Reaction des Nährbodens ist von H. Buchner [Arch. f. Hyg. Bd. 3. 1885] zuerst angegeben.) Es kommt bezüghch der unter dem in. Allgemeine Lebensäusserungen der Bakterien. 45 Unter den chemischen Körpern, welche (als Stoffvvechselproducte) l)ei dem Lebensprocesse der Bakterien entstehen, nehmen eine besondere Stellung ein die sogenannten Fäulnissalkaloide, complicirte stickstoff- haltige Verbindungen basischer Natur, die zum Theil giftig, zum Theil ungiftig sind. Diese Körper werden (nach Selmi) als „Ptomaine" (nTcojua = Leichnam) bezeichnet, da sie zunächst namentlich in ge- faulten Leichentheilen gefunden wurden. Nencki war (1876) der Erste, welcher einen derartigen Körper in reinem, krystallinischem Zu- stande darstellte und seine chemische Zusammensetzung ermittelte. In der Folge hat sich um die Erforschung dieses Grebietes l^esonders L. Brieger^) verdient gemacht. Eine ganze Reihe von Körpern, welche hierher gehören, sind von B rieger sowohl aus künstlichen Culturen bestimmter (meist pathogenerj Bakterienarten wie auch aus Thierorganismen , welche mit bestimmten Bakterienarten inficirt waren, dargestellt worden. Für die giftigen Ptomaine hat Brieger den Namen „Toxine" emgeführt. Eine Gruppe anderer giftiger Stoff- wechselproducte pathogener Bakterienarten, welche keine Alkaloide, son- dern Eiweisskörper sind und als Toxalbumine bezeichnet werden, haben Brieger und C. Fraenkel'-^) entdeckt. Die genannten giftigen StoflFwechselproducte spielen eine wesent- liche Rolle bei jeder durch Bakterien veranlassten Infectionskrankheit. Auf die durch sie bedingte Intoxication des thierischen Organismus sind namentlich die allgemeinen klinischen Symptome, welche bei Infections- krankheiten beobachtet werden, zu l)eziehen. Wir werden dieses Gebiet weiterhin noch zu betrachten haben. Es ist aber hier gleich zu bemerken, dass bei dem Wachsthimi der Bakterien nicht nur giftige Stoff wechselpro du cte, sondern Einflüsse von Bakterienwachsthum sich ausbildenden Eeaction die ursprüngliche Zusammensetzung des Nährbodens sehr in Betracht. Kleine Mengen vou Traubenzucker im Nährboden geben häufig, auch bei alkahbildenden Bakterienarten, zu einem primären Auftreten von freier Säure Veranlassung. (Behring, Zeitschr. f. Hyg. Bd. 7. 1S89. p. 178.) Ebenso bilden viele Bakterienarten auf glycerin- haltigen Nährböden mehr oder weniger beträchth che Mengen von Säure (v. Somma- ruga, Zeitschr. f. Hyg. Bd. 15. 1893. p. 305). Auf den gewöhnhchen, mit Pepton- bouillon hergestellten, zucker- und glycerinfreien Nährböden bilden von bekannten Arten nur der Mlzbrandbacillus , der IMicrococcus tetragenus, der Wurzel- und der Heubacillus Säure, die übrigen Alkali (v. Sommaruga, Zeitschr. f. Hyg. Bd. 12. 1892. p. 277, 278). — Ueber Fettspaltung (Ohvenoel und Einderfett) durch Mikroorganismen hat v. Sommaruga (Zeitschr. f. Hyg. Bd. 18. 1894. p. 441 ff.) systematische Untersuchungen angestellt. ') Untersuchungen über Ptomaine. Berlin (Hirsch wald). 1. u. 2. Theil 1885, 3. Theil 1886. -) Berl. khn. Wochenschr. 1890. No. 11-12. 46 A.. Allgemeines. auch andere giftige Körper entstehen. Es sind dies solche Körper, welche sich nicht Avie die Stoff^^echselproducte ausserhalb der Bakterien- zellen in den Nährsubstraten gelöst befinden, sondern die im Innern der Bakterienzellen selbst vorhanden sind, ohne Zweifel einen wesentlichen Theil der Zelle ausmachen und gewöhnlich nur durch ganz besonders eingreifende chemische Manipulationen (durch die die Zelle jedesmal abgetödtet wird) aus der Zelle extrahirt werden können. Man bezeichnet diese (eiweissartigen) Körper als „Bakterienproteine". Zu den Lebensäusserungen der Bakterien gehört auch die Pro- duction von Farbstoffen (cf. oben p. 9), welche z. Th. von ausser- ordentlicher Schönheit sind. Man nennt die Farbstoff producirenden Bakterienarten chromogene Arten (Pigmentbakterien). Andere Arten lassen den (durchsichtigen) Nährboden prachtvoll fluoresciren: wieder andere leuchten in ihren Cultm-en im Dunkeln (phosphores- ciren). lieber W ä r ni e e n t w i c k e 1 u n g durch Bakterien hat kürzlicb F. Cohn^) berichtet. Zu den Lebensäusserungen der Bakterien gehört endhch die Eigen- thümlichkeit vieler Ai'ten, hn Thier- (oder Pflanzen-) Körper Krank- heitsprocesse hervorzurufen. Wir werden die hierher gehörigen Verhältnisse zum Gegenstande einer besonderen eingehenden Betrach- tung- machen. ^) „Ueber thermogeue Bakterien" (Ber. d. Deutsch. Bot. Ges. 1893; ref. Cen- tralbl. f. Bakt. Bd. 15. p. 424). IV. Allgemeine Methodik der Bakterienbeobaehtung. 1. Die Ausrüstung des Arbeitstisches. Wenn man sich mit Bakterienuntersuchimgen beschäftigen will, so braucht man zunächst eine Reihe von Instrumenten, unter denen das Mikroskop das wesentlichste ist. Das Mikroskop besteht aus einem optischen und einem me- chanischen Theile. Von diesen ist der optische Theil der wichtigere, und man wird daher bei der Beschaffung eines Mikroskopes zunächst auf eine zweckentsprechende Beschaffenheit dieses Theiles zu sehen haben. Der optische Theil des Miki'oskopes setzt sich aus einem Beobachtungsapparat, bestehend aus Objectiv und'Ocular, und aus einem Beleuchtungsapparat , bestehend aus Beleuchtungs- spiegel und Condensorsystem, zusammen. Die genannten opti- schen Stücke werden durch das sogenannte Stativ in Verbindung mit einander gebracht. Ihre Stellung zu einander kann durch beson- dere mechanische Einrichtungen, welche sich an dem Stative vorfinden, je nach dem vorliegenden Bedürfnisse modificirt werden. Es ist nun zwar richtig, dass auch mit einem mangelhaften Stative, falls nur der optische Theil des Mikroskopes gut ist, gearbeitet werden kann. Wer geschickt ist, kann sich für bestimmte Zwecke vorübergehend mit einem derartig mangelhaften Instrumente behelfen. Wer aber nicht nur vor- übergehend mit dem Mikroskope arbeiten, wer Freude am mikroskopi- schen Arbeiten haben will, wer ein universell anwendbares Instrimient braucht, der darf nicht bloss auf den optischen Theil des Mikroskopes Rücksicht nehmen, sondern er muss darauf sehen, dass auch das Stativ den modernen Anforderungen genüge. Beiden Bedingungen, nämlich den optischen sowohl wie den mechanischen, genügen nur die Mikro- 48 A. Allgemeines. skope leistungsfähigster Werkstätten, sogenannter „erster Firmen".^) Man lasse sich nicht durch den niedrigeren Preis verleiten, ein JVIikroskop zu kaufen, an welchem man hinterher beim Grehrauch einen Fehler nach dem anderen entdeckt. Bei der Anschafiung eines ]\Iikroskopes , welches zu Bakterienunter- suchungen bestimmt ist, sind mm eine Eeihe von speciellen Punkten zu berücksichtigen. Von Objectiven braucht man mindestens zwei, nämlich ein schwaches (Zeiss AA, Leitz 3) und ein starkes (Zeiss Oel-Immersion 2mm oder ^l^^'^ Leitz Oel-Immersion ^/la")» ^on Ocu- laren ebenfalls zwei (Zeiss 2, 4, Leitz 1, 4). Man hat so schwache Vergrösserungen von ca. 50 — 100 und starke von ca. 500 — 1000 zur Verfügung. Sehr angenehm ist daneben noch der Besitz eines mittleren Objectives (Zeiss DD, Leitz 7), welches ca. 200 — 450fache Vergrösserung giebt. Der Tubus soll sowohl durch groben Trieb wie durch Miki'ometerschraube verstellbar sein. Der Objecttisch darf nicht zu klein sein, so dass man Culturplatten bequem untersuchen kann. Das Condensorsystem, welches zur Beleuchtung der Objecto dient, soll nach der von Abbe (cf. weiter unten) angegebenen "Weise construh't und auf- und abwärts (am besten durch Trieb) verschiebhch sein ; der Beleuchtungsspiegel soll in seinem Durchmesser den des Abbe'schen Beleuchtungskörpers etwas überschreiten. Sehr nothwendig, kaum zu entbehren für Bakterienuntersuchungen, ist eine Vorrichtung zum schnellen und bequemen Wechseln der Objective (Revolver). Das wesentlichste und bedeutendste Stück des gesammten Mikro- skopes ist das „Oel-Immersions-System", das Objectivs3^stem, welches wir stets benutzen, wenn es sich um eine möglichst stark ver- grösserte Darstellung des Objectes handelt. Bei diesem System wird die Oberfläche des Deckglases des Präparates mit der Fi'ontlinse des Objectivs stets verbunden durch ein Tröpfchen emes Oeles (Cedeniöl), welches dasselbe Brechungsvermögen für das Licht (denselben Brechungs- *) Allen voran schreitet die Firma Carl Zeiss in Jena. Diese Firma lässt sich die höchsten Preise bezahlen ; sie liefert aber auch das Beste. Die sogenannten „Apochr omat-Objective" von Zeiss sind das Vollendetste, was von Objectiven existirt. Ebenso wird die Firma hinsichthch der übrigen optischen Theile der Mikro- skope sowie hinsichthch der Stative von keiner anderen Firma übertroffen. In Berlin sind die Zeiss 'sehen Instrumente vorräthig bei „Carl Zeiss Geschäfts- stelle Berlin, früher G. König", N.W., Dorotheenstrasse 29. Neben Zeiss sind ferner zu nennen Ernst Leitz in Wetzlar (die äusserst preiswerthen Instrumente dieser Firma, welche sich in der Form an die Z e i s s 'sehen anlehnen, werden für die Zwecke bakteriologischer Untersuchung sehr viel verwendet), W. & H. Seibert in Wetzlar, Dr. E. Hartnack in Potsdam, C. Eeichert in Wien und Andere. IV. Allgemeine Methodik der Baktenenbeobachtung. 49 Exponenten) besitzt wie das Glas. Es wird also zwischen Deckglas und Objectivfrontlinse durch das dazwischen gebrachte Cedernöl eine optisch homogene Verbindung hergestellt („Homogene Immersion") Die von dem Objecte ausgehenden Strahlen gelangen ohne irgend welche Ablenkung in das Objectiv. Es gelangt also ein viel grösserer von dem Objecte ausgehender Strahlenkegel zur Wirkung, als es ohne die Zwischenlage des Cedemöles der Fall sein würde ; d. h. das Leis- tungsvermögen eines solchen Objectivs (das Abbildungs- oder Auf- lösungsvermögen^)) muss viel grösser sein als das Leistungs- vermögen eines Systems von derselben Vergrösserung, bei welchem sich zwischen Deckglas und Objectiv eine Luftschicht befindet („Trocken- system"); das Leistungsvermögen muss auch grösser sein als das eines Systems, welches nur Wasser als Immersions-Flüssigkeit ver- wendet („Wasser-Immersions-System"). '•^) Die Immersions- ^) Man versteht hierunter die Fähigkeit mikroskopischer Objective, feine Struc- turen, Details innerhalb der Objecte zur Darstellung zu bringen. Das Abbildungs- vermögen hat seinen Sitz einzig und allein in der Function der Oeffnung des Objectivsystems. Es steht unter allen Umständen in geradem Verhältnisse zu der numerischen Apertur (siehe die folgende Anmerkung). ^) Die in ein Objectivsystem tretende Strahlenmenge wird gemessen durch den Oeffnungs Winkel des Systems. Der Üeffnungswinkel hat seinen Scheitel im Brennpunkte des Systems ; seine Schenkel werden gebildet durch zwei einander gegen- überliegende ManteUinien des von dem Brennpunkte ausgehenden, in das System eintretenden Strahlenkegels. Der Oeffnungswinkel kann naturgemäss niemals den Grenzwerth von ISO*' erreichen. Die Brechungsverhältnisse, welche bei Benutzung eines Trockensystems an der Oberfläche des Deckglases statthaben, bringen es nun mit sich, dass einem von dem Deckglase ausgehenden, die Luft durchsetzenden Strahlenkegel von bestimmter (beispielsweise von ISO**) Weite ein erhebhch engerer ursprünglich von dem Objecte ausgehender, das Deckglas durchsetzender Strahlen- kegel entspricht; der letztere würde, den Brechungsexponenten des Glases zu 1,52 gerechnet, in unserem Beispiele nur 82** 17' Weite haben. Da nun bei der homo- genen Immersion eine jede Ablenkung der Strahlen zwischen Object und Objectiv wegfäUt, so nimmt ein Oel-Immersions-System mit einem Oeffnungswinkel von 82° 17' genau dieselbe Sti'ahlenmenge auf wie ein ideales (übrigens praktisch unmöghches) Trockensystem mit einem Oeffnungswinkel von 180**. Die blosse Angabe des Oeffnungs- winkels eines Systems ohne Angabe, ob es sich um ein Trockensystem, um Wasser- oder Oel-Immersion handelt, giebt also keinen Ausdruck für die Leistungsfähigkeit des Systems. Aus diesem Grunde hat Abbe den Begriff der „numerischen Apertur" geschaffen. Derselbe berücksichtigt zu gleicher Zeit den Oeffnungswinkel und den Brechungsexponeuten des zwischen Deckglas und Objectivfrontlinse befindlichen Me- diums. Man erhält die numerische Apertur, wenn man den genannten Brechungs- exponenten mit dem Sinus des halben Oeffnungswinkels multipHcirt. Der maximale Grenzwerth der numerischen Aperturen beträgt, wie sich aus dem Gesagten leicht ableiten lässt, für Trockensysteme 1,0, für Wasser -Immersionen 1,33, für homogene Immersionen 1,.52. Güntlier, Bakteriologie. 4. Auflage. 4 50 A. Allgemeines. Methode ist von Amici, die homogene Immersion von Stephen- son erfunden. Die ersten derartigen Ohjective wurden von Abbe^j und Z e i s s construii't. Ausser dem Mkroskope brauchen wir für die Bakterienbeobachtung resp. für die Darstellung von Bakterienpräparaten eine Reihe von Utensilien, deren nothwendigste etwa folgende sind : Objectträger. Dieselben sollen von Aveissem Glase, etwa 1,2 mm (jedenfalls nicht über 1,5 mm) dick sein. Das gangbarste Format ist das sogenannte englische (26:76 mm). Objectträger mit hohlem Ausschlifi" (hohlgeschliffene Object- träger). Deckgläser. Man benutzt am bequemsten quadratische Deck- gläser von 18 mm Seitenlänge. Die Dicke soll etwa 0,15— 0,17 mm betragen. Sind die Deckgläser mehrere Hundertstel Millimeter dicker, so gelingt es oft bei Schnitten nicht mehr, das Object mit starken Objectiven in allen seinen Theilen einzustellen; sind sie dünner, so zerbrechen sie zu leicht beim Reinigen-) etc. Flaschen, Glasschälchen, Glastrichter von verschie- dener Grösse. Weite Standgefässe von Glas mit eingeschliffenem Stöpsel zum Härten von Organstücken. Kleine Glas f laschen mit weitem Hals und übergreifendem, lose aufsitzendem glockenförmigem Verschluss zur Aufnahme von C e- dernöl und Canadabalsam. Xach Abnahme des Verschlusses sieht ein kleiner, frei m der Flasche stehender Glasstab zur Flaschen- öffaung heraus, mit Hülfe dessen die genannten Flüssigkeiten tropfen- weise herausgenommen werden können. Zwei Glasmensuren von 10 und 100 ccm Inhalt. ^) Abbe: Ueber Stephenson's System der homogenen Immersion bei Mikroskop- Objectiven. (Sitz.-Ber. d. Jenaischen Gesellsch. f. Med. u. Xaturwiss. 10. Januar 1879.) ^) Die Deckgläser werden von Staub etc. am besten so gereinigt, dass man sie. (in grösseren Mengen) zunächst mit Alkohol übergiesst, den man dann von den einzelnen Gläschen mit dem Lappen wegwischt. GewöhnMch bleiben auf den Deck- gläsern auch bei dieser Behandlung mit Alkohol noch Spuren von Fett zurück; die- selben werden am besten durch Erhitzen der Gläser in der nicht leuchtenden Flamme des Bunsen 'sehen Brenners entfernt. Das Fett lässt sich auch so entfernen, dass man die sauber geputzten Deckgläser (in grösseren Mengen) in den Trockenschrank (cf. oben p. 26) bringt und dort längere Zeit auf hohe Temperaturen erhitzt. — Alte, gebrauchte Deckgläser, die mit Canadabalsam etc. beschmutzt sind, reinige ich auf die Weise, dass ich sie kurze Zeit in kochender Sodalösung halte, dann mit Wasser abspüle, durch Salzsäure von dem anhaftenden Calciumcarbonat befreie, ■wiederum in Wasser und schliesslich in Alkohol gebe, aus dem sie dann heraus- genommen werden, um mit dem Lappen abgetrocknet zu werden. IV. Allgemeine Methodik der Bakterienbeobachtung. 51 Uhrschälchen von c. 60 mm Durchmesser. Mehrere, kleinere und grossere, nicht zu stark federnde ') Pin- cetten. Eine sich auf Druck öfliiende (sogenannte Cornet'sche) Deck- glaspincette. Skalpells, Scheren. Feine Nähnadeln, Xadelh alter. Ein kleiner Messingspatel, dessen Ebene man etwa 2 cm vom Ende entfernt stmnpfwinklig imibiegt. Platindrähte, nicht zu dümi, etwa 60 — 70 mm lang, an Glasstäben angeschmolzen, z. Th. mit ösenförmig gebogenem Ende. B n n s e n b r e n n e r oder S p i r i t u s 1 a m p e. Fliesspapier, Tuschpinsel, Leinwandlappen, Präpa- ratenetiketts, Cartons resp. Kästchen zur Aufoahme von Präparaten u. s. w. Sehr angenehm ist es ferner, ein gutes Mikrotom zur Hand zu haben. Hier sind besonders die Instrumente der Firmen J u n g in Heidelberg, Schanze in Leipzig, Becker in Göttingen zu nennen. Die von Schanze (Weigert'sches Mkrotom) sind die compen- diösesten nnd für unsere Zwecke gebräuchlichsten. Der wichtigste Theil des Miki'otoms ist das Messer, auf dessen Listandhaltung man die gi-üsste Sorgfalt verwenden muss. Bei dem Mangel eines Mikro- toms kann man sich auch mit einem guten Rasirmesser, dessen Klinge auf der einen Seite plan geschliffen ist, behelfen. Ausserdem brauchen wir eine Reihe von Chemikalien, deren wichtigste nachstehend aufgeführt sind: Destillirtes Wasser. Jodkalium. Alcohol absolutus. Glycerin. Äther. Anilin (Anilinöl). Chloroform. Carbolsäure (Phenol). Xylol. Cedemöl. Officinelle Salz-, Salpeter- und ^^elkenöl. Schwefelsäure. Canadabalsam. Eisessig (Essigsäure). Gmmni arabicum. Kali aceticum. Celloidin. Kali- oder Xatronlauge. Yaselin. Ammoniak. Verschlusslack. Jod. ^) Mit stark federnden Pincetten ist das Arbeiten, speciell das Halten der Deckgläser etc., ein ausserordentüch unbequemes. 4* 52 A. Allgemeines. Farbstoffe: Carniin, Pikrinsäure, Eosin, Meth}^!- oder Gentiana- Tiolett, Fuclisin, Methylenblau, Bismarckbrami (Vesiivin). Die Chemikalien, namentlich die flüssigen, bewahren wir in Glas- flaschen mit Glasstöpsel auf. Der Arbeitstisch, an welchem wir mikroskopiren, entsimcht in seiner Höhe einem gewöhnlichen Schreibtische. Der Arbeits- stuhl soll so hoch sem, dass "nir, auf demselben sitzend, bequem in das vertikal aufgestellte Mkroskop hineinsehen können. Die modernen besseren Mkroskope sind zwar sämmtlich mit Einrichtimg zum „Umlegen" versehen. Von dieser Einrichtung wird speciell fiir mikrophotographische Zwecke ein ausgedehnter Gebrauch gemacht. Hier stellt man den Tubus des Miki'oskopes gewöhnlich horizontal. Eine geringe Schrägstellung des Mki'oskoptubus ist sehr angenehm für die Beobachtung; sie kann aber in der Regel nur dann zur An- wendung gelangen, wenn es sich um die Durchmusterung fertiger, fester Präparate handelt. Während des eigentlichen mikroskopischen Arbeitens, wo es sich stets um mehr oder weniger flüssige resp. ver- schiebliche Objecto handelt, Avird man den Objecttisch stets in horizon- taler, den Tubus also in vertikaler Stellung belassen müssen. 2. Beobachtung der Bakterien im lebenden Zustande. Der hängende Tropfen. Wirkungsw^else des Abbe'schen Beleuchtungsapparates. Wenn es sich darum handelt, irgend welche Bakterien zu unter- suchen, so muss man sich zunächst, wenn es irgend ausführbar ist, ein Bild von dem Aussehen derselben im frischen, lebenden Zustande zu verschaffen suchen. Denn nur am lebenden Material kann man Aufschluss erhalten über die Fi'age, ob Eigenbewegung da ist oder nicht, nur im ftischen Zustande koimnen etwaige Unter- schiede in dem Lichtbrechungsvermögen verschiedener Theile der Bakterienzelle zimi Ausdruck, nur im frischen Zustande kann man über die Ai't der Zusammenlagerung der Bakterien in gTÖsseren Ver- bänden (Zoogiöen etc.) Genauestes erfahren. Ausgeschlossen ist freihch die Beobachtung lebender Bakterien in situ in Schnitten thierischer Organe. Wir werden weiterhin noch sehen, dass man zur Sichtbar- machung ungefärbter, in situ befindlicher Bakterien in Schnitten die letzteren so eingreifenden Manipulationen unterwerfen muss, dass von einem weiteren Fortbestande des Lebens der Bakterien dabei keine Rede sein kann. Will man die in thierischen Organen enthaltenen Bakterien lebend untersuchen, so muss man Theilchen der fi-ischen TV. Allgemeine Methodik der Bakterienbeobacbtung. 53 Organe mit "Wasser oder indifferenten Flüssigkeiten (0,75 proc. Kocli- salzlösung, Bouillon) zen'eiben, um dadurch die Bakterien, von den Körperzellen isolirt, in der Flüssigkeit suspendirt zu erhalten. Die mikroskopische Beobachtung lebender Bakterien ist also auf bakterienhaltige Flüssigkeiten beschränkt, die entweder bereits fertig vorliegen, oder die man sich durch VeiTeibung bakterienhaltigen Materials in wässrigen Flüssigkeiten erst herstellt. Will man sich zunächst übungsweise mit diesen Dingen beschäftigen, so empfiehlt es sich, Scheiben gekochter Kartoffeln, welche in der weiter unten (Ab- schnitt V, 2) zu besprechenden Weise hergestellt sind, einige Stunden der Luft auszusetzen und dann in der feuchten Kammer einige Tage lang bei Zimmertemperatm- stehen zu lassen. Es haben sich dann aus den einzelnen Keimen, w^elche aus der Luft auf die Kartoffel nieder gefallen sind, Colonien von Bakterien entwickelt, welche als an Höhe, Flächenausdehnung, Farbe mehr oder weniger verschiedene Häufchen erscheinen. Ein jedes Häufchen zeigt sich dann aus Individuen einer bestimmten Art resp. Fonn zusammengesetzt. Durch Yerrühren kleinster Quantitäten solcher Bakteriencolonien in einem Tröpfchen Wasser oder Aehnlichem lassen sich dann ftir die miki'o- skopische Beobachtung geeig-nete Objecte herstellen. Weiter empfiehlt es sich, etwas Heu, Keis, Erbsen, Brot, Fleisch oder Aehnliches mit Wasser zu versetzen und die resp. Infuse mehrere Tage lang an einem warmen Orte stehen zu lassen. Es entwickelt sich dann in den Infusen ein mehr oder weniger reiches Bakterienleben, und jedes Tröpfchen solcher Flüssigkeiten bietet ein ausgezeichnetes Object für das Studium von Bakterien im lebenden Zustande. Die Methode, deren man sich zur mikroskopischen Untersuchung lebender, in Flüssigkeiten suspendirter Bakterien fast ausschliesslich bedient, ist die des hängenden Tropfens. Um ein derartiges Präparat anzufertigen, nimmt man zunächst einen hohlgeschliffenen Objectträger, dessen Höhlung man mit gelbem Vaselin mittels eines Tuschpinsels imizieht, und den man dann vorläufig bei Seite legt. Kun wird ein reingeputztes (cf. p. 50) Deckglas horizontal auf den Tisch gelegt und mittels der Platinöse ein klemes Ti'öpfchen der bakterienhaltigen Flüssigkeit auf die Mitte des Deckglases gebracht; hat man keine bakterienhaltige Flüssigkeit, sondern mehr consistente Cultm-en oder frische Thierorgane etc. vor sich, so bringt man, wie ol)en bereits besprochen, zunächst ein Tröpfchen reines Wasser,^) ^) Das destillirte Wasser, wie es in den Laboratorien vorrätbio; gebalten wird, ist, besonders wenn es bereits eine Reibe von Wocben bei Zimmertemperatur ge- 54 A. Allgemeines. Kochsalzlüsimg oder Bouillon mit der Platiiiöse auf das Deckglas und verreibt dann (am besten mittels eines gerade endenden Platindrahtes) in dem Tröpfchen eine Spur der Bakterienmasse resp. des Organs, um eine Suspension der Bakterien in der Flüssigkeit zu erhalten. Hierbei sehe man darauf, dass man möglichst wenig, wirklich nur Spuren der Bakterienmasse etc. in der Flüssigkeit vertheilt, weil es sonst sehr schwer, häufig unmöglich Avird, die Individuen miki'oskopisch isolirt zu Gesicht zu bekommen und sich von ihrer Form etc. ein Bild zu verschaffen. Nachdem der Tropfen hergestellt ist, wird der hohlgeschliffene Objectträger, die Höhlung nach unten gekehrt, mittels des Yaselins so auf das Deckglas geklebt, dass das bakterienhaltige Tröpfchen genau in der Mitte des Ausschliffs hegt. Nun wird der Objectträger rasch (um ein Zerfliessen des Tröpfchens zu veraieiden) umgekehrt, und das Präparat ist dann zur Beobachtung fertig. Das Tröpfchen hängt, zur Beobachtung bereit, vor Verdunstung geschützt, fi'ei am Deckglase. Die Platindrähte werden vor und nach jedesmaligem Oe- brauche ausgeglüht; bevor man sie nach dem Ausglühen anwendet, muss man sie wieder erkalten lassen. Um den hängenden Tropfen mikroskopisch zu untersuchen, ver- fährt man am besten so, dass man zunächst mit schwachem Objectiv- system den Rand des Tropfens aufsucht, um diesen Rand nach- her der Beobachtung bei starker Vergrösserung zu unterwerfen. Sehr bequem und fast imentbehrlich hierfür ist die zum schnellen Wechseln der Objective bestimmte, oben Q). 48) erwähnte Revolvervorrichtung, welche den besseren Mkroskopen heutzutage als integTirender Bestand- theil stets beigegeben wird. Den Rand des Tropfens wählt man zur Untersuchung mit starken VergTösserungen einestheils deshalb, weil der Tropfen am Rande am dünnsten ist, und sich Objecte, die eine möglichst dünne Schicht repräsentiren, zm- Untersuchung mit stark vergTösseniden Objectiven naturgemäss am besten eignen; anderntheils bietet der Rand des Tropfens wegen seiner Dünne den einzelnen Bakterienindividuen keinen so weiten Spielraum zum Durcheinander- schwirren etc. wie die übrigen Theile des Tropfens; man wird also am Rande die Formen, um die es sich handelt, gewöhnlich zum Theil standen hat, für diesen Zweck nicht zu empfehlen, da es gewöhnlich zu zahlreiche Bakterien enthält. Auch das reinste destillirte Wasser, welches wir herstellen können, enthält noch Nährstoffe genug, um manchen Bakterienarten eine ausgiebige Ver- mehrung zu gestatten (cf. Bolton, Zeitschr. f. Hyg. Bd. 1. 1886. p. 98, 99). Im Gegensatz dazu ist gutes Leitungs- oder Brunnenwasser sehr arm an Keimen und deshalb für den vorUegenden Zweck sehr gut zu brauchen. IV. Allgemeine Methodik der Bakterienbeobachtung. 55 in Euhe liegen sehen, während man, nach der Mtte des Tropfens zu weitergehend, das Bakterienleben allmählich immer mehr in dem natürlichen, dm'ch die Capillaritätsverhältnisse des Randes nnbeeinflussten Lagernngs- und Bewegungszustande erblickt. Dem Anfänger nicht geringe Schwierigkeiten verursacht nun das Einstellen des Präparates. Es handelt sich dabei um dreierlei verschiedene Dinge: erstens soll die richtige Stelle des Ob- jectes zur Einstellung gelangen; zweitens soll das Bild des Objectes dem Auge scharf erscheinen, d. h. das Objectiv des Mikroskopes soll den richtigen Abstand vom Objecte haben; drittens soll die Beleuchtung des Objectes die richtige, zweckentsprechende sein. Die ersten beiden Punkte sind relativ leicht zu erledigen. Man muss den mittleren Abstand der verschiedenen Objective vom Objecte ungefähr kennen ; man stellt die Objectebene dann zunächst mit schwachem Objectiv unter Benutzung des groben Tubustriebes ein und rückt das Präparat dann mit der Hand so, dass die zu untersuchende Stelle, in unserem Falle also eine Stelle des Tropfenrandes, genau in die Mitte des Gesichtsfeldes kommt. Mt Vortheil wird man sich hierbei eines schwachen Oculars bedienen. Ist die richtige Stelle des Präparates centrisch eingestellt, so geht man mit dem Tubus unter Benutzung des groben Triebes etwas nach oben, wechselt dann unter Benutzung des Revolvers das schwache System gegen das Immersions- S3"stem um, bringt auf das Deckglas centrisch einen kleinen Tropfen Cedernöl und schraubt nun mit Hülfe des groben Triebes den Tubus so lange abwärts, bis die Frontlinse des Immersionssystems in das Oel eintaucht. Dies letztere beobachtet man von der Seite her; man muss dazu die Augen etwa in Höhe des Objecttisches bringen. Ist die Oelverbindung zwischen Deckglas und Objectiv hergestellt, so schraubt man den Tubus wieder etwas in die Höhe, ohne jedoch die Oel- verbindung zu zerreissen, und bringt nun das Auge wieder über das Ocular. Man schraubt nun (am besten, indem man beide Hände an die Schraube des groben Triebes bringt), während man in das Mikro- skop hineinsieht, den Tubus ganz langsam und vorsichtig nach abwärts, bis das Bild erscheint; in diesem Augenblick lässt man den groben Trieb los und bewirkt nun die feinere Einstellung mit Hülfe der Mikrometerschraube, i) ^) Von vornherein gewöhne man sich, das Auge, welches beim mikro- skopischen Sehen unbetheiligt ist, während des Mikroskopirens offen zu halten. Nur ganz zu Anfang wird man durch das von diesem Auge percipirte Bild etwas gestört; bei einiger üebung kommt Einem dieses Bild gar nicht mehr zum Bewusstsein. Es ist aber ein nicht hoch genug anzuschlagender Vortheil mit der 56 A. Allgemeines. Die genannten Manipulationen, welche die richtige Einstellung des Präparates und des Objectives zuni Zwecke haben, setzen jedoch eine richtige, zweckmässige Beleuchtung voraus. Ohne dass man die Beleuchtung, wenigstens annähernd, zunächst regulirt hat, sind diese Manipulationen z. Th. gar nicht ausführbar. Wir müssen uns deshalb mit der Beleuchtung etwas eingehender beschäftigen. Der Beleuchtungskörper des modernen Mikroskopes besteht, wie bereits erwähnt, aus einem Spiegel, welcher die Strahlen der Licht- quelle auffängt, und aus einem Linsensj'stem (Abbe" scher Beleuchtungs- apparat), in welches hinein- die Strahlen von dem Spiegel aus geworfen werden, um schliesslich auf einer relativ kleinen Stelle des Objectes concentrirt zu werden. Es ist nun, wie uns Kob. Kochi) gelehrt hat, das erste Erfordemiss zum Zustandekommen eines guten Bildes — dies gilt für jeden einzelnen Fall, wie auch die Verhältnisse im Uebrigen liegen mögen — , dass die von der Lichtquelle ausgehenden Strahlen in der Objectebene vereinigt werden, d. h. dass ein mög- lichst scharfes Bild der Lichtquelle in der Objectebene entsteht. Wenn ich mit schwachem Systeme das Object scharf ein- gestellt habe, so muss ich also den Beleuchtungskörper meines Mki-oskopes so disponiren, dass ich ausser dem körperlich vorhandenen Objecte noch das (reelle) durch den Beleuchtungskörper in das Object projicirte Bild der Lichtquelle erblicke. Ist die Lichtquelle vom Mikroskope weiter entfernt, wird sie z. B. durch weisse Wolken dar- gestellt, so liegt der Vereinigungspunkt ihrer Strahlen näher an der oberen Linse des Abbe' sehen Apparates, als Avenn die Lichtquelle näher am Mikroskope steht, z. B. durch die Flamme einer auf dem Tische stehenden Petroleimilampe ^) repräsentirt wd. In dem ersteren Falle muss also der Abbe' sehe Apparat höher, dem Präparate näher. Befolgung dieses Käthes verbunden. Beim mikroskopischen Sehen soll nämlich, damit das Auge von unnützer Anstrengung möghchst frei, das Arbeiten ein mög- lichst bequemes sei, die Accommodation völlig erschlafft sein; das Auge soll auf die Ferne eingestellt sein. Eine völlige Erschlaffung der Accommodation ist aber nur dann zu erreichen, M^enn die gesammte Augenmuskulatur sich im Zustande der Euhe befindet, wenn also auch der SchHessmuskel des anderen Auges ausser Thätig- keit ist. 1) Cohn"s Beitr. z. Biol. d. Pfl. Bd. 2. 1877. p. 410. -) Als Lichtquelle benutzt man bei Tage am besten eine helle Stelle des Himmels (weisse Wolken etc.). Directes Sonnenlicht ist für die Zwecke der Beob- achtung nie zu benutzen. Bei Abend benutzt man als Lichtquelle am besten eine gewöhnliche Peü'oleumlampe (Studirlampe). Ein auf die obere Ocularhnse gelegtes oder im Blendungsträger angebrachtes schwach blaues (Cobalt-) Glas dämpft die gelben Strahlen der Flamme und erleichtert das Mila-oskopiren bei Lampenlicht sehr. TV. Allgemeine Methodik der Bakterienbeobacbtiuig. 57 im zweiten muss er tiefer, von dem Präparate weiter entfernt stehen. Diese Ueberlegung erweist die Notliwendigkeit, dass der Abbe 'sehe Apparat verschiebüch sei.^) Es ist an dieser Stelle darauf aufmerksam zu machen, dass der Brennpunkt des Abbe' sehen Apparates für parallel eintretende (d. h. z. B. von einer entfernten Wolke herkommende) Strahlen sehr nahe (in etwa 2 nun Entfernung) an seiner oberen Linse liegt.-) Damit die Strahlen aber Avirklich parallel in den Abbe'schen Apparat eintreten, ist es nothwendig, dass wir die Strahlen der Wolke mit einem Plan- spiegel auffangen und sie dann in den Abbe'schen Aj^parat schicken. Das IVIikroskop trägt nun in seiner Spiegelfassung gewöhnlich zwei Spiegel, nämlich einerseits einen Plan-, andrerseits einen Hohlspiegel. Würden wir den letzteren in unserem Falle anwenden, so würden wir dem Abbe'schen Apparate nicht parallele, sondern convergirende Strahlen zuschicken, und der Brennpunkt derselben würde naturgemäss dann noch viel näher an der oberen Linse des Abbe'schen Apparates liegen, d. h. so nahe, dass an ein Zusammenfallen dieses Brennpunktes mit der Objectebene — da doch unsere Objectträger eine gewisse Dicke haben müssen — nicht mehr zu denken wäre. Es ergiebt sich aus dieser Betrachtung ohne Weiteres die oS^othwendigkeit , bei Be- nutzung des Abbe'schen Beleuchtungsapparates stets den Plan- spiegel, nie den Concavspiegel anzuwenden.") ^) Im Nüthfalle kann das Abbe'sche Beleucbtungssystem durch eine unter der Tischöffnung angebrachte halbkughge Linse, deren plane Seite nach oben ge- kehrt ist, und die, in einer Hülse gefasst, auf- und abwärts verschiebbar ist, ersetzt werden. '-) Die Firma C. Z e i s s fertigt drei verschiedene Condensorsysteme an ; die- selben unterscheiden sich in der Brennweite sowie in der numerischen Apertur (cf. oben p. 49, Anm. 2) von einander. Die oben im Text gemachte Angabe bezieht sich auf den Condensor mit der Apertur 1,20; ausserdem wird ein Condensor von 1,40 num. Ap. und von etwas kürzerer Brennweite als der des vorhergehenden, end- lich ein (achromatischer und centrirbarer) Condensor von 1,0 num. Ap. angefertigt. Der letztere dient hauptsächlich mikro photographischen Zwecken, während die beiden erstgenannten hauptsächlich beim gewöhnlichen mikroskopischen Arbeiten benutzt werden. Für Arbeiten bei Lampenlicht ist im Allgemeinen der Condensor von 1,20 num. Ap. dem von 1,40 num. Ap. vorzuziehen. — Ganz neuerdings hefert die Firma C. Zeiss die Mikroskope auch mit ,, herausklappbarem Conden- sor"; d. h. es ist eine Einrichtung getroffen, den Abbe'schen Condensor, welcher — streng genommen — nur für den Gebrauch mit stark vergrössernden Objectiv- systemen construirt ist, bei Benutzung schwacher Systeme leicht entfernen (zur Seite herausldappen) zu können. ^) Nur beim Beobachten mit ganz schwachen Objectiven, wo der Planspiegel — l}esonders bei Verwendung von Lampenhcht — oft nicht das ganze Sehfeld 58 A. Allgemeines. Die Beleuchtung ist also, wenn wir zunächst mit schwachem Objective das Präparat betrachten, so einzurichten, dass wir den Plan- spiegel benutzen und den Abbe'schen Apparat in eine solche Höhe bringen, dass wir mit dem Bude des scharf eingestellten Objectes zu- gleich ein möglichst scharfes Bild der Lichtquelle erblicken. Kun bleibt aber noch ein sehr wesentlicher Punkt bezüglich der Beleuchtung zu berücksichtigen, d. i. die richtige Disponirung der unterhalb des Abbe'schen Condensorsjstems , zwischen diesem und dem Beleuchtungsspiegel, befindlichen Blendungsvorrichtung. Wenden wir den Abbe'schen Apparat ohne jede Abbiendung an („offener Condensor"). so kommt die ganze Menge der in die untere Linse desselben eintretenden Lichtstrahlen zur Wirkung auf das Object. Die kleine Stelle des Objectes, in welcher sich diese Licht- strahlen vereinigen, ^m-d dann mit Licht überschüttet, welches von allen einzelnen Punkten der obersten Linsenfläche des Abbe'schen Apparates herkonmit. Da nun diese Linsenfläche eine ziemliche Aus- dehnung hat und dem Vereinigungspunkte der von ihr ausgehenden Strahlen sehr nahe liegt, so besitzt der in das Object gelangende Strahlenkegel einen sehr stumpfv\^inkligen Scheitel. Die Kandstrahlen dieses Kegels sind also den ihnen gegenüberliegenden Kandstrahlen nahezu entgegengesetzt gerichtet und paral^^siren dieselben in ihren Diffractions\räkungen nahezu vollständig. Handelt es sich nun um die Darstellung solcher Objecttheile, die sich nur dm'ch Differenzen in dem Licht brechungsver mögen, nicht durchDi f f e r e n z en in der Färbung von ihrer Umgebung unterscheiden, die also über- haupt nur durch Difft-actionserscheinungen, welche an ihren Grenzen zu Stande kommen, sichtbar werden können, so ist naturgemäss der volle, u nah geblendete Abbe'sche Condensor nicht am Platze. Derselbe verhindert das Zustandekommen der Diffractionserscheinungen, d. h. er macht die ungefärbten Objecte mehr oder weniger unsichtbar. Wollten wir uns dagegen solche Objecttheile vor Augen fähren, die sich durch die Färbung von ihrer L'mgebung unterscheiden, so wür- den diese gefärbten Dinge, die für ihre Sichtbarkeit irgend welcher Diffractionserscheinungen nicht bedürfen, bei der geschilderten Be- leuchtung in Folge der gleichzeitigen Auslöschung der Contouren der ungefärbten Objecttheile ganz besonders deutlich, isolirt, zur Erscheinung gelangen. Der Erste, welcher diese Verhältnisse erkannt, scharf definirt und gleiclamässig zu beleuchten erlaubt, ist es gestattet, den Hohlspiegel zu verwenden, „welcher ausschliesslich für diesen Zweck am Apparat angebracht ist". (C. Zeiss, Gebrauchsanweisung für den Abbe'schen Beleuchtungsapparat.) IV. Allgemeine Methodik der Bakterienbeobaehtung. 59 für die Zwecke der praktischen Mikroskopie brauchbar gemacht hat, war Rob. Koch.^) Die Beleuchtung mit vollem Abbe"- schen Condensor vernichtet das „Structurbild", isolirt das „Farbenbild". Diese Beleuchtung wird also überall da am Platze sein, wo es sich um Darstellimg gefärbter Theile des Objectes gegenüber ungefärbten handelt, z. B. bei der miki'oskopischen Dar- stellung von gefärbten Bakterien, die in Schnitten thierischer Organe enthalten sind. Hier werden Avir den vollen Abbe'schen Condensor, zumal wenn es sich um relativ (d. h. gegenüber den Gewebszellen) sehr kleine Bakterien handelt, nicht entbehren können; denn allein diese Beleuchtung löscht die Contouren der ungefärbten Gewebstheile (die, wenn sie sichtbar sind, kleine gefärbte Bakterien sehr gut ver- decken können) aus und lässt die gefärbten Theile dafür desto deut- licher hervortreten. Wollen wir aber ungefärbte Objecto oder Objecttheile zur Anschauung bringen, so dürfen wir- den vollen Abbe" sehen Condensor nicht anwenden. Wir bringen dann ein Diaphragma mit ziemlich enger centraler Oefinung (gewöhnlich einfach „enge Blende" genannt) unter den Abbe "sehen Beleuchtungsapparat. Es werden so die Eand- strahlen abgeblendet, und es kommt dann auf das Object nur eine relativ kleine Menge centraler Lichtstrahlen, ein sehr spitzwinkliger Strahlenkegel, zm- Wii'kung; dieser unterscheidet sich in seiner Wir- kung nicht wesentlich von einem Bündel paralleler Lichtstrahlen und lässt die Contouren ungefärbter Objecttheile deutlich zur Anschauung kommen. Kehren wir nun zu unserem hängenden Tropfen zurück, so haben wiv hier eine Flüssigkeit (Wasser etc.) vor uns, in welcher Bakterien suspendirt sind. Die Flüssigkeit sowohl wie die Bakterien sind ungefärbt. Die Darstellung der letzteren erfordert es also, die Beleuchtungsverhältnisse so einzurichten, wie sie zur Sichtbarmachung des „Stru et Urbildes" nothwendig sind; d. h. wir dürfen bei der Beobachtung des hängenden Ti'opfens nicht den vollen Abbe'schen Condensor anwenden, sondern müssen denselben durch eine enge Blende abblenden.^) ^) Untersuchungen über die Aetiologie der Wundinfectionskrankheiten. Leipzig. 1878. p. 32 ff. -) Die „enge Blende" hat für verschieden starke Objectivsysteme verschiedene Weite. Da nämlich der maximale Beleuchtungskegel, den ein schwaches Objectiv aufzunehmen vermag, ein engerer ist als der, den ein stärkeres System aufzunehmen vermag, so ist der Abbe'sche Condensor für ein schwaches System bereits als „offen", als unabgeblendet zu betrachten bei Anwendung einer Blendenweite, die, bei 60 A. Allgemeines. Das Verfahren der mikroskopischen Einstellung des hängen- den Tropfens würde sich also folgendermassen gestalten: 1) Abbiendung des Condensors mit enger, etwa stecknadelkopf- grosser, ^) Blende. 2) Scharfe, centrale Einstellung des Tropfenrandes mit schwachem System und Planspiegel. 3) Regulirung der Stellung des Abbe'schen Apparates (Ein- stellung des Bildes der Lichtquelle in die Objectebene). 4) Centrirung des Bildes der Lichtquelle durch Regulirung der Spiegelstellung. 5) Hochschrauben des Tubus und Auswechseln des schwachen Sj^stems gegen das Immersionssystem. 6) Erweiterung der Blende bis zu etwa ErbsengTösse. -) 7) Bringen eines Tropfens Cedemöl auf das Deckglas. 8) Vorsichtiges Mederschrauben des Tubus mit Hülfe des groben Triebes bis zum Eintauchen des Systems in das Oel. Zurückschrauben des Tubus, ohne die Oelverbindung zu zerreissen. 9) Vorsichtiges, langsames Mederschrauben des Tubus mit Hülfe des groben Triebes bis zum Erscheinen des Bildes im Mikroskope. 10) Loslassen des groben Triebes und letzte Regulirung der Ein- stellung dm"ch die Mikrometerschranbe. 11) Sollte das Gesichtsfeld sich nicht au allen Stellen gleich- massig beleuchtet zeigen, so kann man diesen Fehler durch minimale Verstellung des Spiegels ohne Weiteres beseitigen. Es möge hier ein für alle Mal darauf hingewiesen werden, dass man sich bei der mikroskopischen Betrachtung eines jeden Objectes — besonders wenn starke Objective zur Verwendung kommen — zu- einem stärkeren System in Anwendung gebracht, hier nicht dem voUen Beleuchtungs- kegel, sondern nur einem centralen Theile dessell^en den Durchtritt gestattet. Ob bei einer bestimmten mikroskopischen Beobachtung der für das gerade benutzte Objectiv- system „volle" Beleuchtungskegel in Wirkung ist (ob „die Apertur des Systems [cf. p. 49, Anm. 2] voll ausgenutzt" ist), prüft man am besten so, dass man das Ocular aus dem Tubus entfernt und dann in den Tubus central hineinsieht. Er- scheint die obere Linse des Objectivsystems in ihrer ganzen Ausdehnung von licht erfüllt, so ist der volle Beleuchtungskegel in Wirkung. Ist der Beleuchtungskegel mehr oder weniger reducirt, so findet man nur eine kleinere oder grössere centrale Partie der oberen Objectivhnse von Licht erfüllt. — Die „enge" Blende hat bei schwachem Trockensystem (Zeiss A, Leitz 3) zweckmässig etwa Stecknadelkopf- grösse, bei Oelimmersionssystemen zweckmässig etwa Erbsengrösse. ^) cf, die vorige Anmerkung. -) cf. die vorletzte Anmerkung. IV. Allgemeine Methodik der Bakterienbeobachtung. ßl nächst stets eines möglichst schwachen Oculars bedient. Das schwache Ocular hat dem starken gegenüber eine grosse Menge Vor- theile: Das Bild ist lichtstärker und schärfer; die Schärfe wird weniger von geringen Verschiebungen der Mikrometerschraube beeinfiusst; das Gesichtsfeld umfasst einen grösseren Theil des Objects; alles in allem: das Arbeiten mit schwachem Ocular ist leichter, angenehmer und be- quemer als mit starkem. Speciell auch das Durchmustern eines Präparates ist bei Anwendung eines schwachen Oculars erheblich leichter. Es ist also eine feststehende Regel, dass man zunächst immer das schwache Ocular benutzt. Stösst man dann auf eine Stelle, die man bei stärkerer Vergrösserung betrachten möchte, so wechselt man die Oculare aus, greift aber sofort wieder auf das schwache Ocular zurück, wenn man weitere Theile des Präparates betrachten will. Will man nach der Beobachtung des hängenden Ti-opfens das am Deckglas hängende Bakterienmaterial vernichten, so geht man zu diesem Zwecke am besten in folgender Weise vor : Man dreht das auf dem hohlgeschliffenen Objectträger mit Vaselin angeklebte Deckglas unter Zuhülfenahme zweier Finger so weit um seinen Mittel- punkt, bis eine Ecke des Deckglases über die Objectträgerkante herüber- ragt. Der hängende Tropfen selbst muss hierbei dauernd in der Mitte des Objectträgerausschliffs bleiben und darf den Objectträger selbst nicht berühren. Dann erfasst man das Deckglas an der hervor- ragenden Ecke und hebt es langsam vom Objectträger ab. Das Deck- glas mit dem Bakterienmaterial wird in ein Gefäss mit Desinfections- flüssigkeit versenkt, der vaselinirte Objectträger kann ohne Weiteres für einen neuen Versuch verwendet Averden. 3. Das gefärbte Deckglas-Trockenpräparat. Die Anilinfarben. Das Princip der maximalen Beleuchtung. Haben wir uns durch die Untersuchung des hängenden Tropfens über das Aussehen eines Bakteriengemisches im lebenden Zustande informii't, haben wir uns, wenn es sich um eine bestimmte Bakterien- art handelt, durch die genannte Methode von eventuell bestehender Eigenbewegung etc. überzeugt, so gehen wir daran, uns ein Dauer- präparat für unsere Sammlung anzufertigen. Ein solches Dauer- präparat hat aber nicht nur den Zweck, eine dauernde Erinnerung an resp. einen dauernden Beleg für einen bestimmten Befund zu bilden oder als ein unveränderliches Demonstrationsobject zu dienen. Wir sind vielmehr für manche Zwecke direct gezwungen, uns ein solches 62 A. Allgemeines. Präparat anzufertigen. Wenn wir z. B. Bakterien pliotographiscli ab- bilden wollen, so müssen wir sie (in der Regel) aus dem beweglichen Zustande, in welchem sie zunächst vorhanden sind, in einen fixü-ten Zustand überführen, sie dauernd festlegen. Wenn wir feststellen wollen, ob ein Sputum Tuberkelbacillen enthält oder nicht, so bedürfen wir hierzu eines Verfahrens, in welchem die dauernde FLxirimg des Unter- suchungsobjectes einen wesentlichen Punkt bildet. Die Methode, welche wir anwenden, um bakterienhaltige resp. auf Bakterien zu untersuchende Flüssigkeiten in die Form des Dauer- präparates zu bringen, stammt von E. Koch. ^) Koch fand, dass Bakterien, die in dünner Schicht am Deckglase angetrocknet werden, in ihren Formen sehr gut erhalten bleiben und sich dann, am Deck- glase fixirt, färben und ausgezeichnet conserviren lassen. Zur Her- stellung eines solchen „Trockenpräparates" taucht man den eben ausgeglühten und wieder erkalteten Platindraht mit der Spitze in die bakterienhaltige resp. zu untersuchende Flüssigkeit (Blut, Eiter, Sputum, Gewebssaft, bakterienhaltiges Pfianzeninfus, Faulflüssigkeit etc.) ein und streicht das am Drahte hängen gebliebene Material in möglichst dünner Schicht auf einem rein geputzten-) Deckgiase'^) aus. Es empfiehlt sich hierbei, nicht nur die wirkliche Spitze des Drahtes zmn Ausstreichen zu benutzen, sondern das Ende des Drahtes in Länge von etwa 1 cm flach auf das Deckglas aufzulegen und dieses letzte Stück des Drahtes in seiner ganzen Ausdehnung zum (quer gerichteten) Ausstreichen der Flüssigkeit zu verwenden. Haben ^vii- consistenteres Material zu unter- suchen, z. B. Colonien von der Kartoffel etc., so müssen wir dieses Material, ähnlich wie dies auch bei der Herstellung des hängenden Tropfens geschah, zunächst in flüssige Form bringen. Wir bringen zu dem Zwecke zunächst (mit Hülfe des Platindrahtes) ein kleinstes Ti'öpfchen reines Wasser auf das Deckglas und verreiben nachher in diesem Wasser und mit demselben ein kleinstes Partikelchen des zu 1) Cohn's Beitr. z. Biol. cl. Pfl. Bd. 2. 1S77. p. 401 ff. — Mitth. a. d. Kais. Ges.-Amte. Bd. 1. 18S1. jx 5. -) cf. p. 50, Anm. 2. *^) Manche Praktiker pflegen das Material behufs späterer Färbung und Unter- suchung nicht auf dem Deckglase, sondern auf dem Objectträger aus- zustreichen. Diese Praxis hat sich vielfach, einestheils um Deckgläser zu sparen, anderntheils um die Arbeit abzukürzen, eingebürgert. Die richtige ,,Fixirung" (siehe p. 63) des so disponirten Materials ist etwas schwieriger als die Fixirung des auf dem Deckglase ausgestrichenen Materials. Nach der Färbung, Abspülung und Trocknung (siehe weiter unten) solcher Objectträgerpräparate wird das Immersionsöl (ohne Zwisehenlage eines Deckglases) direct auf die gefärbte Schicht gebracht. Die Methode ist zuerst von Neisser (Zeitschr. f. Hyg. Bd. 4. 1888. p. 174) angegeben. IV. Allgemeine Methodik der Bakterienbeobachtung. 63 imtersiiclienden Materials, indem wir für möglichste Flächenausbreitmig desselben in möglichst dünner Schicht Sorge tragen.^) Ist das Material auf dem Deckglase vertheilt, so kommt der zweite Act des Verfahrens: das Trocknen des vertheilten Materials. Dasselbe soll bei gewöhnKcher Temperatur an der Luft geschehen, nicht unter Erhitzung in der Flamme.") Gewöhnlich sind nur Bruch- theile einer Minute dazu erforderlich, das Präparat „lufttrocken" werden zu lassen. Ist das Präparat lufttrocken geworden, so kommt Punkt 3 an die Reihe: das Fixiren der Schicht. Wir wollen nämlich die Bakterien- schicht hinterher färben ; zum Zwecke der Färbung muss aber die Schicht mit wässerigen Farbstofflösungen und dann mit Wasser bespült werden ; und dabei werden, wenn man nicht besonders für eine Fixirung der Schicht gesorgt hat, sehr häufig — es braucht dies nicht immer zu geschehen, geschieht aber oft — Theile dieser Schicht hermitergespült. Um das zu vermeiden, wird die Schicht durch Er- hitzung fixirt, d. h. es werden die schleimigen Hüllen der Bakterien, vermöge deren dieselben am Glase festgeklebt sind, in Wasser weniger quellbar gemacht, so dass die Bakterien nun fester am Glase haften. Koch führte diese Erhitzung ein nach dem Vorgänge von Ehrlich ,•") welcher dieselbe speciell für Blutpräparate als ein zweckmässiges Fixirungsmittel gefunden hatte. Man kann zum Zwecke der Fixirung die Deckgläser 2—10 Minuten in einen auf 120—130^ C. erwärmten Trockenschrank bringen. Es genügt jedoch für die allermeisten Fälle eine viel einfachere Methode: Das mit der Pincette^) gefasste, horizontal gehaltene Deckglas wird, mit der Schicht nach oben gekehrt, dreimal hintereinander durch die nicht leuchtende Flamme des B uns en" sehen Gasbrenners oder durch eine kräftige Spiritusflamme gezogen. Man beschreibt dabei mit der Hand unter stetiger Bewegung dreimal emen vertikal gestellten Ki-eis, der einen Fuss im Durchmesser hat, und den die Hand jedesmal in einer Secunde zurücklegt. Diese genaue Angabe ^) Wenn wir wässeriges Material vor uns haben, so gelingt eine gieich- inässige Ausbreitung nur dann, wenn das Deckglas vollkommen rein, namentlich vollkommen fettfrei, ist. Das Letztere wird am schnellsten und besten durch Erhitzen des Gläschens in der Flamme erreicht (cf. p. 50, Anm. 2). -) Eine ganz leichte Erwärmung zum Beschleunigen des Trocknens ist gestattet. Man darf das Präparat z. B. in der erwärmten Luft, welche sich etwa 60 cm über der Flamme des Bunsenbrenners befindet, trocknen. ä) Zeitschr. f. klin. Med. Bd. 1. 1880. ■*) Für diese sowie für die folgenden Manipulationen empfiehlt sich sehr die Anwendung der oben (p. 51) bereits erwähnten sogenannten Com et 'sehen Pincette- 64 A. Allgemeines. der Geschwindigkeit der Bewegung stammt von John e, ^) welcher die- selbe in seinen Erinnerungen an die ersten ,,Choleracm-se" im Koch"- schen Institute aufgezeichnet hat. Man könnte versucht sein, eine derartig genaue Vorschrift für die Schnelhgkeit, mit der man das Deckglas durch die Flanmie zu ziehen hat, für* überflüssig zu halten. Dieselbe ist jedoch nichts weniger als überflüssig. Erhitzt man das Präparat bei dem „Fixiren" zu stark, so büssen die Bakterien an ihrer Fähigkeit, Farbstoffe aufzunehmen, ein, und zwar um so mehr, je weiter die Erhitzung gegangen ist. Vor allem hat man sich vor einem, wenn auch noch so kurzen, Verweilen des Präparates in der Flamme zu hüten. Die Bewegung soll stetig sein; nm' ganz vorübergehend soll die höhere Temperatur einwirken. Steht man einen Moment in der Flamme still, so ist die weitere Brauchbarkeit des Präparates verscherzt. Auf der anderen Seite soll aber das Präparat wrkhch „fixirt" werden; und dazu gehört ein bestimmter Grad der Erhitzung. Man hat also bei dieser Manipulation eine gewisse (für verschiedene Untersuchungs- objecte übrigens etwas verschiedene) Mittelstrasse einzuhalten, die durch die obige Angabe im Allgemeinen ziemlich genau bestimmt wird. Ist das Trockenpräparat fixirt, so ist es zur Färbung fertig. Die Färbung wird auf die Weise ausgeführt, dass man eine geeignete Farblösung auf die angetrocknete Schicht brmgt und den Ueberschuss der Farblösung nach kürzerer oder längerer Zeit mit geeigneten Flüssig- keiten (meist Wasser) herunterspült. ^) Vor der Färbung kann man das Trockenpräparat durch kürzeres oder längeres Eintauchen in eine Sublimatlösung desinficiren; man wird dies z. B. dann thun, wenn Einem daran liegt, pathogenes Material möglichst bald unschädlich zu machen. Die Länge der Einwirkung der Sublimatlösung, welche dazu nothwendig ist, variirt je nach der Beschafienheit des zu desinficirenden Materiales. Die Färbbarkeit der Bakterienzellen -nird nach meinen Er- fahrungen auch durch stundenlange Einwirkung der gebräuchlichen SalzsäuresubKmatlösung (1 Sublimat, 5 Salzsäure, 1000 Wasser) nicht verändert. ^) ^) Ueber die Koch 'sehen Reinculturen und die Cbulerabacillen. Leipzig. 1S85. p. 19. '-) Die Färbung des Präparates braucht nicht sofort nach der Antrocknung und Fixirung des Materials zu geschehen ; man kann das fixirte Präparat, vor Feuchtigkeit geschützt, vor der Färbung beliebig lange aufbewahren. '') Es möge hier bemerkt werden, dass, obgleich manchen Anilinfarben eine hohe bakterienschädigende Wirkung zukommt, doch nicht etwa jede Bakterien- zelle durch die Aufnahme von Farbstoff abgetödtet wird. IV. Allgemeine Methodik der Bakterienbeobachtung. 65 Als Farbstoffe verwendet man zur Bakterienfärbung fast aus- scbliesslicli gewisse Anilinfarben. Es ist zwar richtig, dass sich Bakterien auch mit anderen Farbstoffen, z. B. Haematoxylin, Carmin, tingiren lassen ; jedoch ist die Intensität solcher Färbimgen mit den durch Anilinfarben hervorgebrachten nicht zu vergleichen. Der Erste, welcher Anilinfarben zum Färben von Bakterien verwendete, war Weigert. ^J Es ist hier der Ort, einige Bemerkungen über das Wesen der Anilinfarben im Allgemeinen und über ihre Verwendbarkeit in der mikroskopischen Technik zu machen. Die Anilinfarben leiten sich in letzter Linie ab von den beiden Körpern Anilin und Toluidin, welche ihrerseits aus den beiden (in dem Steinkohlentheer enthaltenen) Kohlenwasserstoffen Benzol resp. Toluol durch Eintritt einer NH,-Gruppe (AmidogTuppe) an Stelle eines Wasserstoffatoms in den Benzolkern entstanden sind. Aus dem Anilin oder dem Toluidin oder aus beiden zusammen lassen sich nun solche Körper herleiten, welche basische, und solche, die sam-e Eigenschaften haben. Und man kann die Anilin- farben als Salze auffassen, welche entweder dadurch entstehen, dass sich ein solcher basischer Körper mit irgend einer Säure verbindet, oder dadurch, dass einer der sauren Abkömmlinge mit irgend einem anderweitigen basischen Körper eine Verbindung eingeht. In dem ersteren Falle ist das färbende Princip des entstehenden Salzes offenbar basischer Natur, während in dem letzteren Falle der saure Bestandtheil des Salzes den färbenden Antheil darstellt. Ehrlich^) unterscheidet so „basische" Anilinfarbstoffe und „saure" Anilinfarbstoffe. Es hat sich nun gezeigt, dass in der Wirkungsweise dieser beiden Gruppen sehr erhebliche Unterschiede bestehen. Bringt man beispiels- weise von zwei gleichen Schnitten thierischen Gewebes den einen in eine Farbflüssigkeit, welche mit einem basischen Anilinfarbstoffe her- gestellt ist, den anderen in die Lösung eines sauren Anihnfarbstoffes, so findet man in der Färbung der nach weiterer zweckmässiger Be- handlung resultii'enden Präparate die erheblichsten Differenzen. Der saure Farbstoff hat das Gewebe diffus, in allen seinen Theilen gleichmässig gefärbt; der basische Farbstoff hat vor Allem die Kerne des Gewebes gefärbt, die anderen Bestandtheile haben weniger Farbstoff aufgenommen. Die basischen Anilinfarbstoffe sind also durch ^) Ueber eine Mykose bei einem neugeborenen Kinde. — Schles. Gesellsch. f. vaterl. Cultur. Breslau. 10. Dec. 1875. (Jahresbericht, p. 229.) -) Zeitschr. f. klin. Med. Bd. 1. 18S0. p. 556. Günther, Bakteriologie. 4, Auflage. 5 66 A. Allgemeines. eine besondere Affinität zu den Kernen des thierischen Gewebes ausgezeichnet, und man bezeichnet sie daher auch als kernfärbende Anilinfarbstoffe, während man die sauren auch als diffus färbende bezeichnet. Die am häufigsten angewandten basischen (k e r n f ä r b e n d e n) Anilinfarbstoffe sind: Fuchsin (Rubin, Magenta) [rother Farbstoff]. Gentianaviolett, Methjdviolett (Dahlia). Methylenblau. Bismarckbraun (Vesuvin). Zu den sauren (diffus färbenden) Anilinfarbstoffen gehören unter Anderem Eosin, Pikrinsäure. Die Kerne des thierischen Gewebes und die Protoplasmakörper der Bakterienzellen zeigen nun gewisse Analogien in ihren Eigenschaften, die unter Anderem auch in dem Verhalten der beiderseitigen Dinge gegen Farbstoffe zum Ausdrucke kommen. So wie die Gewebskeme durch eine besondere Affinität zu den basischen Anilinfarbstoffen ausgezeichnet sind, so sind dies auch die Bakterien. "\Vii- brauchen deshalb zur Bakterienfärbung ausschliesslich die basischen (kernfärbenden) Anilinfarbstoffe. Zm* Herstellung der Färbungsflüssigkeiten verfährt man, je nach dem Farbstoff, den man verwenden will, verschieden. Bei den beiden Violetten, dem Fuchsin, dem Methylenblau empfiehlt es sich, gesättigte Lösungen in absolutem Alcohol (welcher das ausgezeichnetste Lösungsmittel für diese Farbstoffe ist) anzustellen, die als Stammflüssigkeiten dienen, zum Färben jedoch an sich nicht verwendet werden können. Diese gesättigten alcoholischen Lösungen werden dann zum Gebrauche mit etwa dem zehnfachen Volumen Wasser verdünnt. Die schliesslich anzuwendenden Farb- lösungen müssen stets wässerige sein resp. einen hervorragenden Wassergehalt besitzen. Der Grund, weshalb man nicht die unmittelbar gebrauchsfähigen wasserhaltigen Farblösungen von vornherein in gTÖsseren Quantitäten anstellt, ist der, dass die mit Wasser versetzten Lösungen gewöhnlich nur eine beschränkte Haltbarkeit besitzen. Eine nach obiger Vorschrift durch Vermischen der gesättigten alcoholischen Lösung mit der zehnfachen Wassermenge hergestellte Violett- oder Fuchsinlösung wirkt , frisch bereitet, ausserordentlich schön ; bald jedoch, spätestens nach mehreren Wochen, neigen diese Flüssigkeiten dazu, Niederschläge ausfallen zu lassen; sie färben dann weniger in- tensiv und bedecken das Präparat gern mit grösseren oder kleineren, mitunter sehr dicht gesäeten Fleckchen, welche als „Farbstoff- IV. Allgemeine Methodik der Bakterienbeobachtung. 67 niederschlage" bekannt sind und das Präparat häufig unbrauchbar machen. Dies gut für die violetten und die Fuchsinlösungen. Den Methylenblaulösungen kommt etwas derartiges nicht zu. Me- thj^lenblaulösungen sind unbeschränkt haltbar. Wir werden also, wenn wir Bakterien violett oder fuchsinroth färben wollen, uns im Allgemeinen frisch bereiteter, durch Vermischen gesättigter alcoholischer Stammlösungen mit Wasser hergestellter Farb- lösungen bedienen. Was noch das Bismarckbraun im Speciellen an- geht, so empfiehlt es sich, diesen Farbstoff in gesättigter wässeriger Lösung anzuwenden.^) In der Wirkungsweise der verschiedenen genannten Farbstoffe auf die Präparate sind übrigens ganz bestimmte Unter- schiede vorhanden. Das Bismarckbraun, welches fiäiher, namentlich für die Zwecke der Mki'ophotographie , unentbehrlich war, wird jetzt (wenigstens für Deckgiastrockenpräparate) nur verhältnissmässig wenig noch angewendet, weil wü- einerseits gelernt haben auch anders als braun gefärl)te Bakterien zu photographiren , und weil das Bismarck- braun manche Bakterienarten (wie z. B. die Tuberkelbacillen) schlecht oder gar nicht färbt. Am intensivsten färben und von ganz allgemeiner Anwendbarkeit für alle Bakterienarten sind die violetten Farbstoffe und das Fuchsin. Das Methylenblau^) färbt zarter und lässt in dem Bakterienleibe oft noch feine Differenzen des Inhalts nach der Färbung erkennen, die bei Anwendung der Violette oder des Fuchsins vollstäudig verschwinden, in der Totalfärbmig des Bakterienkörpers untergehen. Für Trockenpräparate von eiweisshaltigem Material (Blut, Eiter etc.), welches auf Bakterien untersucht werden soll, empfiehlt sich vor Allem die Methylenblaufärbung, weil bei dieser das Plasma des Blutes, Eiters etc. nel weniger gefärbt wird, als wenn Fuchsin oder Violett zur Verwendung gelangt, und weil somit die Bakterien, Leukocj-ten etc. viel besser zur Darstellung kommen. 1) R. Koch (Cohns Beitr. z. Biol. d. Pfl. Bd. 2. 1S77. p. 406) empfahl seiner Zeit eine concentrirte Lösung des Bismarckbrauns in einem Gemisch von Wasser und Glycerin zu gleichen Theilen. -) In Trockenpräparaten, welche mit Methylenblau gefärbt sind, findet man häufig einzelne Dinge röthlich gefärbt, während andere eine rein blaue Farbe an- genommen haben. Man erklärt dies dadurch, dass das Methylenblau gewöhnlich kein chemisch reiner Körper ist , sondern noch andere , rothe und violette , Farbstoffe enthält. In Ausstrichpräparaten der Milz von Milzbrandmäusen, die mit Methylen- blau behandelt wurden, habe ich häufig die Milzbrandbacillen röthlich, die Kerne der Leukocyten rein blau gefärbt angetroffen. — Die Kapseln der MilzbrandliacUlen (siehe weiter unten unter „Milzbrandbacillus") erscheinen in Methylenblau trockenpräparaten häufig hellröthlich im Gegensatz zu dem blau gefärbten Protoplasmakörper. 68 A. Allgemeines. Kehren wir nun zu unserem Deckglas-Trockenpräparate zurück, welches wir, zur Färbung bereit, verlassen hatten. Wir fassen das Präparat mit einer kleinen, in der linken Hand gehaltenen gewöhn- lichen Pincette (oder mit der Corne tischen Pincette [cf. oben p. 51]) so in. horizontaler Lage, dass die angetrocknete Schicht nach oben sieht; wir bringen dann einige Tropfen wässeriger Farblösung auf diese Schicht (am besten mit Hülfe einer kleinen Pipette, welche aus der die Farblösung enthaltenden Flasche heraussieht), wir lassen die Farblösung einige Secmiden einwirken und spülen dann mit Wasser den Ueber- schuss ab. ^) Die Schicht muss sich dann gefärbt zeigen. Mit Hülfe eines Glasrohres oder auch ohne ein solches blasen wir dann das über- schüssige Wasser von der gefärbten Schicht herunter, wischen die andere Deckglasseite mit einem Leinwandläppchen oder mit Fliesspapier trocken, ziehen eventuell das Deckglas mit nach oben gerichteter Schicht noch einige Male durch die Flamme, um es vollständig zu trocknen, und sind nun mit der Färbung fertig. r Um recht saubere Präparate zu erhalten , empfiehlt es sich nach memen Erfahrungen sehr häufig, das gefärbte und abgespülte, noch nasse Präparat für eine Secunde in ganz dünne Essigsäure (1 Eisessig -j- 200 Wasser) zu tauchen, es dann sofort mit viel Wasser abzuspülen und hinterher mögKchst schnell zu trocknen.'^ Diese Essigsäure- behandlung, welche weiter nichts bedeutex als eine ganz leichte Entfärbungsprocedur (cf hinten, Abschnitt Vs, 5), befreit sehr häufig die gefärbten Bakterienzellen von zufälKg anhaftenden, aus dem Nähr- boden etc. stammenden, mitgefärbten verunreinigenden Anhängseln. Nach der Färbung wird das Präparat auf den Objectträger auf- gekittet (zur Conservirung „eingeschlossen"). Wir verwenden zu diesem Zwecke fast ausschliesslich Canadabalsam.-j Der Canada- balsam ist ein von bestimmen Coniferen stammendes terpentinähnliches Harz, welches in äusserst zähflüssigem Zustande im Handel erscheint ^) Hierbei hat man darauf zu achten , dass auch die etwa zwischen den Pincettenl^ranchen angesammelte Farbflüssigkeit durch Aussi^ülen der Branchen ent- fernt werde. ") Nur selten werden andere Einschlussmittel verwandt. Mit Bisniarckbraun gefärbte Präparate können auch in Glycerin, violett- oder fuchsingefärbte Präpa- rate können auch in essigsaurem Kali (1 Theil auf 2 Theile Wasser) conservirt werden (E. Koch, F. Cohn's Beitr. z. Biol. d. Pfl. Bd. 2. 1877. p. 407). (Solche Präparate müssen dann mit einem Lackrahmen versehen werden, welcher die Conservirungsflüssigkeit nach aussen abschliesst. Am besten eignet sich Asphalt- lack für diesen Zweck [eine Lösung von Asphalt in Leinöl und Terpentin]. Der Lackverschluss mrd mit Hülfe eines Pinsels in der Weise hergestellt, dass sowohl IV. Allgemeine Methodik der Bakterienbeobachtung. 69 imd für unsere Zwecke erst verdünnt werden muss. Die Verdünnung wurde früher hauptsächlich mit Terpentinöl oder mit Chloroform bewirkt. Es hat sich aber gezeigt, dass diese beiden Körper sich gegen gefärbte Objecte, namentlich gegen mit Anilinfarben gefärbte Bakterien, durch- aus nicht gleichgültig verhalten. Sie wirken allmählich entfärbend. Als durchaus indifferenter Körper hat sich jedoch in dieser Hinsicht das Xylol erwiesen, und dieses würde ich deshalb ganz allein zur Verdünnung des Balsams empfehlen. Das Xjdol, ein Dimeth}^- benzol, ist eine leicht bewegliche, in ihrem Gerüche zwischen Benzol und Bittermandelöl stehende Flüssigkeit, die, ohne Rückstand zu hinter- lassen, verdunstet. (Zum Verdünnen des Balsams nimmt man die Hälfte seines Volumens bis zum gleichen Volumen Xylol je nach dem Zwecke, dem der verdünnte Balsam dienen soll.^ Für Deckglastrockenpräparate braucht man einen dünneren, zum Conserviren von Schnitten einen dickeren „Xylol-Balsam". ) Das Aufkitten des Trockenpräparates mit dem Xylol-Balsam auf den Objectträger (oder das „Ein schli essen" des Präparates) wird so ausgeführt, dass man auf die Mitte des reingeputzten Objectträgers ein kleines Tröpfchen des Balsams^) bringt und dann, vorsichtig und langsam, das Deckglas, mit der gefärbten Schicht nach unten, mit einer feinen Pincette gefasst, mitten auf den Objectträger, d. h. auf das Balsamtröpfchen legt. Benutzt man zu der letzten Manipulation nicht die Pincette, sondern nur die Finger, so ist man genöthigt, im letzten Moment das Deckglas fallen zu lassen; und es kommt dann der Eand des Deckglases wie die angrenzenden Theile des Objectträgers von dem bestreichenden Pinsel getroffen werden.) — Handelt es sieht nicht um Conservirung, sondern nur um mikroskopische Besichtigung der gefärbten Deckglaspräparate, so kann man auch Cedernöl oder (jedoch viel weniger zweckmässig) Wasser als Einschlussmittel verwenden. — In einzehien seltenen Fällen kann es auch zweck- mässig sein, die Präparate in Luft einzuschliessen (cf. weiter hinten in diesem Ab- schnitt die Darstellung der Geisseifäden). ^) Der Balsam wird am besten Ln den (p. 50) beschriebenen kleinen weithal- sigen Fläschchen mit (lose aufsitzender) ül)ergreifender Kappe aufbewahrt. In dem Fläschchen steht permanent ein dünnes Glasstäbchen mit rund verschmolzenen Enden, welches nach Abhebung der Kappe aus dem Fläschchen heraussieht , und mit Hülfe dessen der Tropfen Balsam herausgehoben wird. Ganz unbrauchbar sind die (für andere Keagentien ganz brauchbaren) sogenannten Cobaltflaschen für unseren Zweck; sie ähneln den beschriebenen Flaschen, unterscheiden sich von denselben aber da- durch, dass der Glasstab durch einen eingeschliffenen, nach unten in die Flasche hinein verlängerten Stopfen ersetzt ist. Man wird diese Gefässe nach kurzem Ge- brauche verwerfen; denn es ist bei ihnen nicht za vermeiden, dass der Balsam über den Maschenrand herausquillt und die Aussenwand des Gefässes , den Tisch eto. beschmutzt und verschmiert. 70 A. Allgemeines. häufig zur Bildung kleiner Blasen^) innerhalb des Balsams, welche unter Umständen geeignet sind, die Beobachtung des Präparates zu stören. Unter dem Deckglase breitet sich der Balsam je nach seiner Consistenz rascher oder langsamer aus und bildet schliesslich eine Verbindung des Deckglases in seiner ganzen Ausdehnung mit dem Objectträger. Man hüte sich übrigens, zu viel des Balsams auf den Objectträger zu bringen. Begeht man diesen Fehler, so quillt der Balsam unter den Eändem des Deckglases hervor, kommt dann bei der nachherigen mikroskopischen Betrachtung eventuell mit dem Oel des Immersionssystems zusammen, vermischt sich mit demselben, verändert den Brechungsexponenten der Immersionsflüssigkeit, und man muss sich dann der Mühe unterziehen, das Immersionssystem sowohl wie die Oberfläche des Deckglases sauber (am besten mit Benzol oder Xylol) abzuputzen, den überflüssigen Balsam zu entfernen, und kann dann die Beobachtung von Keuem begiimen. Ein weiterer Verschluss des aufgekitteten Präparates ist nicht nothwendig. Innerhalb weniger Tage ist der Balsam ziemlich fest, innerhalb einer Reihe von Wochen an den Eändem steinhart, und das Präparat ist dann ein echtes, wirkliches Dauerpräparat. Die Färbung hält sich, wenn man die Präparate im Dunkeln aufbewahrt, dauernd unverändert. Es ist selbstverständlich, dass man unmittelbar nach der Herstellung des Präparates dasselbe mit einer genauen Bezeichnung (am besten wird dieselbe auf einem aufgeklebten Etikett^) angebracht) versieht, welche die näheren Daten über die Herstammung des Materiales und namentlich auch Datum imd Jahreszahl der Herstellung angiebt. Will man übrigens ein Ti'ockenpräparat, welches vor längerer Zeit gefärbt und in Canadabalsam eingeschlossen wurde, wieder von dem Objectträger herunternehmen, z. B. um es auf einen anderen Objectträger aufzukitten oder es mit einer anderen Farbe zu färben (es „umzufärben") etc., so braucht man nur den Objectträger von unten her über der Flamme leicht (nicht zu stark '^j) zu erwärmen. Der Balsam wird sofort wieder etwas flüssiger, und man kann dann mit einem kleinen Hölzchen oder Aehnlichem das Deckglas von dem ^) Bemerkt man in dem Balsamtropfen Blasen, bevor man das Deck- glas auflegt, so kann man dieselben leicht dadurch entfernen, dass man sie mit der Spitze des soeben in der Flamme erhitzten, noch heissen Platindrahtes berührt. ^) Man mache es sich (aus nahehegenden Gründen) zur Kegel, im bakterio- logischen Laboratorium die aufzuklebenden Etiketts nicht anzulecken, sondern sie auf irgend eine andere Weise mit Wasser anzufeuchten. ^) Es sei hier bemerkt, dass in Balsam eingeschlossene Bakterienpräparate, die stark (etwa bis zu beginnender Blasenbildung des Balsams) erhitzt werden, die Färbung hierbei verlieren. IV. Allgemeine Methodik der Bakterienbeobachtuiig. 71 01)jectträger herunterschieben und es ohne Weiteres mit einem neuen Tröpfchen Balsam auf einen anderen Objectträger aufkitten. Beabsichtigt man eine Umfärb ung, so wird das heruntergeschobene Deckglas längere Zeit (am besten für 24 Stunden) in Xylol, das man zweck- mässiger Weise mehrmals erneuert, gebracht, bis der Balsam vollkommen heruntergelöst ist. Dann kommt das Deckglas in absoluten Alcohol zur Entfernung des Xylols, dann in eine der weiter unten zu be- sprechenden Entfärbungsflüssigkeiten, wird nach erfolgter Entfärbung in Wasser abgespült und kann nun mit beliebiger Farblösung wieder gefärbt, dann abgespült, getroclmet und wieder aufgekittet werden. Nach dieser Abschweifung wollen wir uns unserem Trocken- präparate wieder zuwenden, welches wir gefärbt, in Balsam ein- geschlossen und damit zur Beobachtung fertig gemacht hatten. Während wir zur mikroskopischen Betrachtung des hängenden Tropfens aus genauer erörterten Gründen darauf angewiesen waren, uns zunächst eine bestimmte Stelle des Präparates (nämlich den Rand des Tropfens) aufzusuchen, um diese zu untersuchen, haben wir es zum Zwecke der genaueren mikroskopischen Prüfung des gefärbten Trockenpräparates nicht nöthig, eine solche bestimmte Stelle aufzusuchen. Das Trocken- präparat stellt ein sehr dünnes, in horizontaler Ebene ausgebreitetes Object dar, dessen einzelne Theile mehr oder weniger gieichwerthig sind; und es ist deshalb gleichgültig, welche Stelle des Deckgiäschens wir zunächst unter die Linse bringen, falls nur überhaupt an dieser Stelle Theile der gefärbten Schicht vorhanden sind. Gewöhnlich legt man deshalb das Präparat so auf den Objecttisch, dass die obere Linse des Abbe'schen Apparates und das Deckglas concentrisch über einander liegen, dass also die optische Axe des Mikroskopes durch die Mitte des Deckgläschens geht. Dann wird ein Tröpfchen Cedernöl ^) auf die IVIitte des Deckgiäschens gebracht und, ohne dass erst eine Beobachtung mit schwachem System erfolgt, das Lnmersionssystem in der oben (p. 55) beschriebenen Weise unter Benutzung des groben Tubustriebes in das Oel hineingesenkt. Nachdem die Berührung der Linse mit dem Gel erfolgt ist, wird, wie dies bei der Einstellung des hängenden Tropfens ^) Es sei gestattet, an dieser Stelle ein Wort über den Modus der Entfer- nung des Cedernöls vom frischen Präparate nach der abgeschlos- senen mikroskopischen Beobachtung zu sagen: Am besten begnügt man sich zunächst damit, durch ein auf das Deckglas aufgelegtes Stückchen Eliesspapier den flüssigen Ueberschuss des Oels herunterzunehmen. Der auf dem Deckglas ver- bleibende Rest des Oels wird nach einigen Wochen, wenn der Balsam völlig fest geworden ist und das Deckglas also fest am Objectträger haftet, mit einem in Benzol oder Xylol getauchten Läppchen entfernt. 72 A. Allgeraeiues. geschah, der Tubus Avieder etwas in die Höhe geschraubt, ohne dass die Oelverbindung dabei auseinander reisst. Dann bringt man das Auge über das Ocular und regulirt nun zunächst provisorisch die Spiegel- stellung so, dass das Gesichtsfeld, in welchem zimächst ein Bild noch nicht sichtbar ist, überhaupt nur eine gewisse HelKgkeit zeigt. Dann wird durch vorsichtiges und langsames Herunterschrauben des Tubus mit Hülfe des groben Triebes das Bild zum Erscheinen gebracht und in dem Momente des Erscheinens der grobe Trieb verlassen und die weitere feinere Einstellung des Bildes mit der Mikrometerschraube vollzogen. Nim ist zwar das Objectiv resp. der Tubus in die richtige Stellung zum Objecte gebracht; das Bild wird aber nur in Ausnahmefällen sich jetzt schon so zeigen, me wir es definitiv zu sehen "nünschen. Ein wichtiger Punkt ist noch zu erledigen: die endgültige ßegulirung der Beleuchtung. Wir hatten die Beleuchtung zunächst nur so ein- gerichtet, dass überhaupt Strahlen der Lichtquelle, von dem Spiegel reflectirt, durch das Abbe 'sehe Condensorsystem in das Objectiv ge- langten. Es kommt jetzt noch darauf an, die Stellung des auf- imd abwärts verschieblichen Abbe 'sehen Apparates so zu regulii'en, dass der Vereinigungspunkt der aus ihm heraus in das Ob- ject eintretenden Lichtstrahlen in dem Objecte selbst liegt. Denn dies ist, Avie wir oben (p. 56) hervorgehoben haben, zum Zustandekommen eines möglichst guten Bildes stets erforderlich. Um diese zweckmässigste Stellung des Beleuchtungskörpers zu finden, kann man sich entweder des Verfahrens bedienen, das wir oben bei der Einstellung des hängenden Tropfens anwandten, und das darauf beruht, dass man, indem man das Object mit schwachem Objectiv ansieht, den Abbe'schen Apparat so stellt, dass das Bild der Licht- quelle in der Objectebene direct sichtbar wird. Will man aber das schwache Objectiv umgehen (und dies pflegt man bei der Betrachtung gefärbter Trockenpräparate gewöhnlich zu thun), so findet man jene zweckmässigste Stellung des Beleuchtimgskörpers auf eine etwas andere Weise. Hat man nämlich zimächst, wie erörtert, überhaupt bei irgend welcher Beleuchtung das Bild mit dem Lnmersionssj^stem möglichst scharf eingestellt, so bringt man nun das Princip der maximalen Beleuchtung zur Anwendung; d. h. man regulirt Abbe- und Spiegelstellung gleichzeitig so, dass das Centrimi des Gesichtsfeldes resp. das Object sich möglichst hell beleuchtet zeigt. Es ist klar, dass dies Letztere nur dann zu Stande kommen kann, wenn die von der Lichtquelle ausgehenden Strahlen sich genau in dem Objecte oder in der Objectebene vereinigen. Das Princip, die Beleuchtung IV. Allgemeine Methodik der Bakterienbeobachtung. 73 maximal zu machen, ist also identisch mit dem Prin- cipe, das Bild der Lichtquelle in das zu beobachtende Object zu projiciren; und ich darf daher das Princip der maximalen Beleuchtung, welches übrigens zuerst von mir ^) in dieser Fassung aufgestellt resp. definirt worden ist, ganz allgemein für das mikroskopische Arbeiten empfehlen. N^och ein Wort über das rein manuelle Vorgehen bei dem Ein- stellen dieser maximalen Beleuchtung: Vorausgesetzt, wir hätten das Object mit dem Immersionssystem bei irgend welcher Beleuchtung zunächst möglichst scharf eingestellt, so würden wir weiterhin nur an der Spiegelstellung und an der Stellung des Abbe 'sehen Condensors eventuelle Aenderungen vorzunehmen haben. Wir bringen dann die linke Hand an den Trieb des Abbe'schen Apparates, die rechte an die Spiegelfassung, richten den Spiegel zunächst so, dass die Mtte des Gesichtsfeldes oder das Gesichtsfeld überhaupt möglichst stark beleuchtet ist, mid schrauben nun den Abbe' sehen Apparat auf- oder abwärts, je nachdem die Lichtstärke in der ersten oder in der zweiten Bewegungs- richtung zunimmt, bis wir zum Maximum der Lichtstärke gekommen sind. An der Spiegel Stellung nehmen wii- nur dann in den einzelnen Momenten dieser Eegulirung der Abbe-Stellung Veränderungen vor, wenn die Beleuchtung aus dem Gesichtsfelde herausgehen resp. nicht centrisch bleiben sollte. Bei einem ideal construirten Mikroskope ist dies allerdings nicht der Fall ; die meisten, auch die besten Instrumente, zeigen aber Fehler in der Centrirung des Abbe'schen Condensors, und diese werden durch geringe Aenderungen der Spiegelstellung corrigirt. Nun würde noch feinste Einstellung der Bildschärfe mit der Mikrometerschraube erfolgen; und dann ist die gesammte Disposition des Mikroskopes die zweckmässigste , die unter den gegebenen Be- dingungen möglich ist. Man kann die maximale Beleuchtung noch auf eine andere Weise einstellen: Nachdem man nämlich mit Hülfe des Immersionssystems das Object zunächst bei irgend welcher Beleuchtung möghchst scharf eingestellt, d. h. dem Objectiv die richtige Entfenmng vom Objecte gegeben hat, entfernt man das Ocular aus dem Tubus (ohne den letz- teren zu verstellen), blickt dann central in den Tubus, hinein und disponii-t nun die Spiegelstellung und die Stellung des auf- und ab- wärts verschieblichen Abbe'schen Beleuchtungskörpers so, dass die obere Objectivlinse möglichst hell leuchtend erscheint, und dass der Mittelpunkt der leuchtenden Partie mit dem Centrimi der Linse zu- 1. Auflage dieses Buches. 1S90. p. 56. 74 A. Allgemeines. sammenfällt. Die hierzu nothwendigen Stellungen des Spiegels und des A b 1d e ' sehen Apparates findet man durch Ausprobiren (Hin- und Herschieben etc.) sehr leicht in wenigen Secunden. Bringt man nun das Ocular in den Tubus zurück, so hat man nur noch event. die letzte feine Einstellung der Bildschärfe an der Mkrometerschraube vorzunehmen, um die zweckmässigste Disponirung des Mikroskopes für den gegebenen Fall erreicht zu haben. Dass wir bei der Einstellung des gefärbten Präparates keine Abbiendung des Abbe' sehen Condensors vornehmen, sondern den- selben voll zur Wirkung kommen lassen, ist nach den oben (p. 58) über die Functionen des Abbe' sehen Apparates gegebenen Erörterungen selbstverständlich. ^) Das Verfahren der mikroskopischen Einstellung des gefärbten T r o c k e n p r ä p a r a t e s wüi'de sich also folgendermassen gestalten : 1) Position des Präparates auf dem Objecttisch so, dass etwa die Glitte des Deckgläschens in der optischen Axe liegt. 2) Bringen eines Tropfens Cedemöl central auf das Deckglas. 3) Vorsichtiges Niederschrauben des Tubus mit Hülfe des gToben Triebes bis zum Eintauchen des Immersionssystems in das Oel. Zurück- schrauben des Tubus, ohne die Oelverbindung zu zerreissen. 4) Entferaung jeder Blendung unterhalb des Abbe'schen Apparates. Stellung des Planspiegels so, dass das Gesichtsfeld (irgendme) beleuchtet erscheint. 5) Vorsichtiges, langsames Xiederschrauben des Tubus mit Hülfe des groben Triebes bis zum Erscheinen des Bildes. 6) Loslassen des groben Triebes und möglichste Scharfstellung des Bildes mit Hülfe der jMikrometerschraube. 7) Herstellung der maximalen Beleuchtung durch Regulu'ung der ^) Arbeitet man bei Lampenlicht, so ist das Mkroskopiren bei der ge- schilderten Beleuchtung, namenthch wenn man sch'^'ache Oculare verwendet, für ein normales Auge höchst unangenehm. Das Auge wird durch die Fülle der Licht- strahlen erheblich geljlendet. Man mache es sich, wenn man seine Augen lieb hat, zur Eegel, bei der Beobachtung mit Lampenlicht und vollem Condensor stets blaue Gläser zu benutzen (cf. p. 56, Anm. 2). Es ist nicht statthaft, das Licht dadurch abzustumpfen, dass man den Condensor abblendet, oder dass man durch vertikale Verschiebung des Condensors von dem Principe der maximalen Beleuchtung abweicht. Denn in den beiden letzteren Fällen würde man mit engerem Beleuch- tungskegel arbeiten, Diffractionssäume an den Contouren der Objecte erzeugen und ein Zustandekommen des gewünschten (und für die meisten Zwecke unumgänglich . nothwendigen) reinen Farbenbildes (cf. p. 59) vereiteln. IV. Allgemeine Methodik der Batterienbeobachtung. 75 Abbe- und Spiegelstellmig nach einer der oben Q). 73) angegebenen Methoden. Hat man auf diese Weise eine Stelle des Präparates eingestellt, so unterwirft man dieselbe der Besichtigung und kann dann, die eine Hand am Präparate, die andere an der Mikrometerschraube, durch Verschiebung des Präparates sich beliebige weitere Stellen des Präparates zur mikroskopischen Anschauung bringen. An der Beleuchtung braucht man währenddessen naturgemäss nichts zu ändera. An einem solchen gefärbten Trockenpräparate zeigen sich nun die einzelnen Bakterien, und zwar der Protoplasmakörper der- selben, mehr oder weniger intensiv gefärbt. Sind die Hüllen (cf. p. 9) stärker entwickelt, so kommen sie als weniger intensiv oder auch als kaum gefärbter den Protoplasmakörper imigebender Hof deut- lich zur Erscheinung (vgl. Taf. V, Fig. 27 ; Taf. XH, Fig. 67 und 69). Häufig finden mr in einem gefärbten Trockenpräparate (und dasselbe gilt auch fiir die später zu besprechenden Schnittpräparate) nicht alle Indinduen (die zu derselben Art gehören) gieichmässig ge- färbt. Neben solchen, deren Protoplasmakörper sich gieichmässig intensiv tingirt hat, sehen wir andere, die unregelmässig, blass, lückenhaft gefärbt erscheinen. Beispiele hierfür sieht man auf Taf. n, Fig. 9, femer auf Taf. VI, Fig. 34. Es handelt sich hier mn Individuen, die in D e g e n e r a t i o n begriffen oder vollständig degenerirt sind, und deren Protoplasma damit die Fähigkeit verloren hat, sich in der normalen Weise mit Fai'bstoffen zu beladen. Der Verlust der Färbbarkeit lässt mit Sicherheit auf eingetretenen Tod schhessen (R. Koch^)); andererseits ist es aber nicht statthaft, aus der erhalten gebliebenen Färbbarkeit den Schluss zu ziehen, dass das Individuum vor der Präparation noch völlig lebenski'äftig war, wie Untersuchungen von B a u m g a r t e n und B r a e m -) gezeigt haben. — Wir haben hier von unregelmässiger, lückenhafter Färbung gesprochen und dieselbe auf Degeneration beziehen dürfen. Nicht zu verwechseln damit ist eine andere färberische Erscheinung, welche man bei mannichfachen Bakterien- arten, und zwar bereits bei jungen Reinculturen derselben, in denen von einer Degeneration sicher keine Eede ist, beobachten kann: Während (bei kurzer Behandlung des Präparates mit unseren Farb- lösungen bei Zimmertemperatur, wie oben geschildert) \ie\e Bakterien- zellen den Farbstoff kräftig aufgenommen haben und sich intensiv gefärbt zeigen, sind andere, gleichgestaltete Zellen äusserst schwach *) Untersuchungen über die Aetiologie der Wundinfections-Krankheiten. Leipzig. 1878. p. 53. -) cf. Centralbl. f. klin. Med. 1888. No. 29. 76 A. Allgemeines. gefärbt. Von einer lückenhaften, ungleichmässigen Auf- nahme des Farbstoffs sieht man hier nichts. Ein Beispiel dafür (junge T3-])husbacillencultur) zeigt Taf. YIII, Fig. 45. Es handelt sich in solchen Fällen nicht um den Unterschied zwischen lebenskräftigen Zellen einerseits und degenerirten andererseits, sondern es handelt sich um lebenskräftige Zellen verschiedener Resistenz: die blassgefärbten Zellen sind resistenter als die intensiv gefärbten. Be- handelt man nämlich derartiges Material mit intensiver wirkenden Färbungsproceduren (cf. weiter unten, Abschnitt IV, 5), so färben sich die Zellen sämmtlich gleichmässig intensiv. Etwas Derartiges ist bei degenerirtem Material niemals der Fall; hier ist eben die normale Färbbarkeit verloren gegangen, und — mr mögen Färbungsproceduren anwenden, welche wir wollen — es resultiren stets lückenhaft, un- regelmässig oder auch gar nicht gefärbte Zellen. Sind in dem Trockenpräparate Bacillen vorhanden, welche aus- gebildete Sporen enthalten, so zeigen sich die letzteren als un- gefärbte Körper innerhalb des Bacillenleibes, der im Uebrigen noch ganz noraial gefärbt sein kann (cf. Taf. IV, Fig. 19 und 21; Taf. VE, Fig. 37 und 40). Man hüte sich aber davor, jede ungefärbte Stelle in einem gefärbten Bacillus als „Spore" anzusprechen. Die ausgebildete Spore hat eine resistente Membran (cf. oben p. 16). welche auch dem Eindringen von Farbstofflösungen einen sehr erheblichen AYiderstand entgegensetzt. Aus diesem Grunde erscheinen im gefärbten Ti'ocken- präparat die Sporen gewöhnlich ungefärbt; aber es können innerhalb von Bacillen Stellen auch aus anderen Gründen ungefärbt bleiben" z. B. wenn (wie wir eben auseinandergesetzt haben) das Protoplasma bei beginnender Degeneration hier und da seine Färbbarkeit eingebüsst hat. Ferner kommt es auch, wie Büchner^) gezeigt hat, vor, dass bei dem Zutritte der Farblösung das Bacillenprotoplasma sich inner- halb der Bacillenmembran etwas contrahirt-) und so eine ungefärbte vacuolenartige Stelle entsteht. Zur sicheren Diagnose einer „S p r e" ist ausser der Beobachtung des Färbimgsverhaltens vor Allem der iS'achweis der Keimfähigkeit des Gebildes nothwendig. Hat man Blut auf Bakterien zu untersuchen, so kann man sich mit Yortheil der geschilderten Methode der Darstellmig des gefärbten Trockenpräparates bedienen. -"j Bei richtiger Erhitzung des Präparates (gelegentlich der Fkirung) zeigen sich dann die Bakterien am inten- 1) Centralbl. f. Bakt. Bd. 4. ISSS. No. 1-2—13. -) Vergl. oben p. 10 „Plasmolyse". •*) Vergl. p. 67 (Empfehlung des Methylenblaus für die Untersuchung eiweiss- haltiger Flüssigkeiten). IV. Allgemeine Methodik der Bakterienbeobachtung. 77 sivsten gefärbt, die rothen Blutkörperchen iii ihrer Gestalt erhalten und weniger intensiv gefärbt, das Plasma wenig gefärbt. Mitunter stört aber die Färbung der Blutkörperchen und des Plasma die Bakterien- färbung resp. Bakterienbeobachtung, und es ist dann mit Vortheil ein Verftihren anzuwenden, welches ich^) ursprünglich zur Färbung von Recurrensspirillen in Blutpräparaten angegeben, dann aber zur Darstel- lung von Bakterien in Blutpräparaten überhaupt^) empfohlen habe. Dies Verfahren beruht darauf, dass durch Abspülen der getrock- neten und fixirten Blutpräparate mit dünner (1 — 5 procentiger) wässe- riger Essigsäurelösung das Haemogiobin aus den Blutscheiben extrahirt und ein grosser Theil des Plasma von dem Griase heruntergewaschen wird, ohne dass die Fixirung der Bakterien dabei leidet. Ti'ocknet man hinterher die Schicht wieder, so kann man sie nun wie gewöhnlich färben, und man erhält so eine ziemlich isolirte Färbung der Bakterien; die Blutkörperchen erscheinen nur noch wie blosse Schemen und stören das Bild der gefärbten Bakterien nicht mehr. Fig. 70 auf Tafel Xu (Recurrensspirillen in Blut) ist nach einem auf die beschriebene Weise hergestellten Präparate aufgenommen. Die eben geschilderte Methode lässt aber manchmal im Stich, wenn die Blut- schicht bereits vor sehr langer Zeit am Deckglas angetrocknet und das Präparat in diesem Zustande aufbewahrt wurde. Das Plasma ist dann so fest am Deckglase angetrocknet, dass es nicht gelingt, dasselbe mit Essigsäurelösimg abzuspülen. Hier habe ich^) mit Erfolg folgenden Kunstgriff angewendet: Ich behandelte so eingetrock-nete Schichten mit 2 — 3proc. wässeriger Pepsinlösung. Das Plasma wurde in km-zer Zeit peptonisirt, die Bakterien blieben wohl erhalten und Hessen sich hinterher gut färben. Eine Doppelfärbung von Blut-Trockenpräparaten, die Bakterien enthalten, erreicht man durch Behandeln der Präparate mit einer Farblösung, die ein Gemisch von Methylenblau und Eosin dar- stellt (Chenzinsky'sche'^j Eosin-Methylenblaulösung). Man nimmt zweckmässig^) ein ganz frisch bereitetes Gemisch von 2 — 3 Vol. gesättigter wässeriger Methylenblaulösung, 1 Vol. ^/gproc. Eosinlösung in 70 bis 75proc. Alcohol, 2 Vol. Wasser. ^) Fortschritte d. Medicin. 18S5. p. 755. -) Deutsche med. Wochenschr. 1887. No. 22. ") Deutsche med. Wochenschr. 1887. No. 22. ^) Chenzinsky (Centralbl. f. Bakt. Bd. 3. 1888. No. 15) hat (Uese Mischung zuerst, und zwar zur Färbung von Malariablut-Präparaten, angegeben. ^) cf. die Arbeiten von Plehn (Aetiologische und klinische Malariastudien. BerUn 1890) und von Canon (Virch. Arch. Bd. 131. 1893. p. 404). 78 A. Allgemeines. Auch die weiterhin noch zu besprechende Gram' sehe Methode lässt sich bei geeigneter Xatur der Objecte für Deckglastrockenpräparate (speciell auch für Bhitpräparate) verwenden. Zur mikroskopischen Darstellung von Mikroorganismen im Hörn ge webe hat Unna\) folgende Methode angegeben: Die be- treffende Hornschuppe (Kruste, Comedo etc.) wii'd auf einen Objectträger gelegt und mit einem Tropfen starker Essigsäure befeuchtet. Ein zweiter Objectträger wii'd auf den ersten gelegt, und es wird durch Drücken und Reiben der beiden Objectträger gegen einander das in der Essig- säure aufquellende Material zu einem Brei zerrieben. Die Objectträger werden dann von einander gehoben und zur Verdunstung der Essig- säure rasch über der Flamme getrocknet. Die ziemlich abgekühlten, aber noch warmen Objectträger werden, nach einander, mit etwas Aether-Alcohol-jMischung begossen, welche das Fett aus dem angetrock- neten Materiale extrahirt; die ablaufende fetthaltige Flüssigkeit wird von einem Handtuche aufgesogen, mit Hülfe dessen man den Object- träger zwischen den Fingern hält. Das entfettete Material wird mit Methylenblaulösung '^j unter gelinder Erwärmung gefärbt, mit Wasser abgespült, mit dünner Essigsäurelösung (oder anderen passenden Mitteln) differenzirt % mit Wasser oder Alcohol oder beiden abgespült, über der Flamme getrocknet*) imd in Balsam eingeschlossen. Unna nennt so hergestellte Präparate „ D r u c k p r ä p a r a t e". Den folgenden Abschnitten vorgreifend wollen wir hier schon darauf aufmerksam machen, dass eine jede Färbung bei höherer Temperatur schneller vor sich geht und unter Umständen überhaupt bessere Resultate giebt als die Färbung bei niedrigerer Temperatur. '") Von dieser Thatsache kann man manchmal bei der Darstellung von Trockenpräparaten Gebrauch machen. Findet man nämhch, dass sich ein bestimmtes Material (cf. oben p. 76 die Bemerkungen über resis- tentere Zellen) bei der gewöhnlichen geschilderten Behandlung nur massig färl)t, dass die Bakterienzellen sich im Allgemeinen oder z. Th. ^) Die Färbung der Mikroorganismen im Horngewebe. Hamburg und Leipzig. 1891. -) Unna vera'endet folgende Lösung : Borax und Methylenblau ana 1,0, destil- lirtes Wasser 100,0. ^) Ueber „Differenzirung" der Färbung siehe weiter unten (Abschnitt IV, 4). *) cf. hierzu das über ,,Antrockuungsmethode" im nächsten Abschnitt (IV, 4) Gesagte. ^) Dies entspricht der oben (p. 35) erwähnten wichtigen Thatsache, dass ein jedes chemische Desinfectionsmittel bei höherer Temperatur energischer wirkt als bei niedrigerer. So wie das Desinfectionsmittel l^ei der höheren Temperatur schneller in die BakterienzeUe eindringt, so thut dies auch der Farbstoff. IV. Allgemeine Methodik der Bakterienbeobachtung. 79 nur schlecht mit Farbstoff beladen, so kann man oft ganz gute Bilder erzielen, wenn man das mit der Pincette gehaltene, fixirte und mit Farbstofflösung bedeckte Deckgläschen für wenige Secunden mitten in die Gas- oder Spiritusflamme bringt. Die Farbflüssigkeit fängt dann an zu dampfen und wird, ehe sie einzutrocknen beginnt, mit Wasser in der gewöhnlichen Weise heruntergespült. Durch die bisher geschilderten Methoden, gefärbte Trockenpräparate darzustellen, wii'd, wie bereits besprochen, das Bakterienprotoplasma gefärbt; auch die Hülle nimmt oft in gewisser Weise Färbung an. Ungefärbt hingegen bleiben fast ausnahmslos^) die Geis seif ä den, die Bewegungsorgane der eigenbewegiichen Bakterienarten (cf. oben p. 14). Methoden, Geisseifäden an Bakterien zur Anschauimg zu bringen, wurden zuerst von E. Koch angegeben. Koch wies diese Gebilde zu- nächst an einigen Spirillen- und Bacillenarten nach, die, am Deck glase angetrocknet, ungefärbt und ohne Zusatz einer Einschlussmasse bei bestimmter Beleuchtung die Geisseifäden sehr deutlich erkennen liessen.2) Durch eigene Versuche habe ich mich davon überzeugt, dass es bei solchen Bakterienarten, welche nicht zu zarte, sondern relativ kräftige Geissein besitzen, ein Leichtes ist, die letzteren im ungefärbten Präparate zm* Anschauung zu bringen. Die in AVasser suspendirten Bakterien werden in dünnster Schicht auf dem Deckglase ausgebreitet ; man lässt die ausgebreitete Wasserschicht verdunsten und befestigt das Deckglas dann so auf einem Objectträger , dass es, die Bakterien- schicht nach unten gekehrt, nüt seinem Bande auf einem Rähmchen von dünnem Papier ruht, welches mit dem Objectträger sowohl wie mit dem Deckglas durch Canadabalsam verbunden wii'd. Auf diese Weise stellt man sich leicht Dauerpräparate her, bei denen das am Deckgiase haftende Bakterienmaterial in einer (nach aussen hin abgeschlossenen) Luftschicht eingeschlossen ist. Bei Anwendung von Oelimmersion, Abbe'schem Condensor und mittelweiter Blende sieht man dann bei passendem Material (siehe oben) ohne Weiteres die Geisseifäden. Ein Beispiel zeigt Fig. 1 5 auf Taf. IH. Das Präparat, aus faulendem Stroh- ^) Eine Ausnahme in dieser Beziehung machen solche Bakterieuarten , die ausserordenthch kräftige, nach den specifischen Geisselpräparationsmethoden unter allen Umständen leicht darstellbare GeisseLn besitzen. Hierhin gehört z. B. Spirillum Undula, dessen Geissein auf Taf. III, Fig. 15 und 16, dargestellt sind. Diese Art, im Trockenpräparate mit einer gewöhnlichen wässerig-alcoholischen Farbstofflösung behandelt, zeigt sehr häufig (nicht in jedem Präparate) die Geissein ohne Weiteres gefärbt. Neuerdings hat Bessert (Centralbl. f. Bakt. Bd. 16. 189-1. p. 346) über gelungene Geisseifärbung bei einfacher Anwendung wässerig-alcoholischer Farblösungen auch bei anderen Bakterienarten (mit zarteren Geissein) berichtet. 2) F. Cohn's Beitr. z. Biol. d. Pü. Bd. 2. 1877. p. 404, 416—417. 80 A. Allgemeines. infus hergestellt, zeigt Spirillum Undula und grosse Bacillen mit Geissei- fäden bei lOOOfaclier Yergrössernng. Einschalten möchte ich hier, dass es nur — bei sehr grossen Spirillen mit sehr ki'äftigen Geissein — mehrmals gelungen ist, die letzteren im hängenden Wassertropfen zu sehen. Diese Beob- achtung, welche, soviel mir bekannt, von anderer Seite bisher nicht gemacht worden ist, zeigt, dass die Substanz der Geisseifäden bei den in lYage kommenden Arten ein Lichtbrechungsvermögen besitzt, welches das des Wassers erheblich übertrifft. Im Allgemeinen sind die Geissei- fäden — selbst bei ki-äftiger Ausbildung — bei der Beobachtung des Materials im hängenden Tropfen unsichtbar; ohne Zweifel deshalb, weil sie sich in ihrem Brechungsvermögen von dem Wasser meist nur ganz unerheblich unterscheiden. Eine Methode, Geisseifäden zu färben, wurde ebenfalls zuerst von R. Koch ermittelt. Die Färbung gelang mit gesättigter wässe- riger Lösung von Ex tr actum campechianum^); mit Anilinfarben färbten sich die Geisseifäden nicht. -j Lmnerhin hat man mit Hülfe der von Ko-ch angegebenen Methoden nur bei wenigen Arten beweglicher Bakterien Geisseifäden nachzuweisen vermocht. Ln Jahre 1889 ist dann von Loeffler'^j ein Verfahren gefimden worden, welches die Geissein der Färbung mit Anilinfarben ganz allgemein zugänglich gemacht und eine ganz universelle Darstell- barkeit dieser Gebilde ermöglicht hat. Loeffler behandelt die Trocken- präparate zunächst mit einer Beize; dadm'ch werden die Geissein befähigt, Anilinfarbstoflfe aufzunehmen. Das Loeffler 'sehe Gei s s elf ärbungs verfahren, welches der Autor später^) noch verbessert hat, gestaltet sich in dieser ver- besserten Form folgendermassen : Das Bakterienmaterial wird, möglichst frei von schleimigen oder eiweisshaltigen Beimengungen und möglichst frei von anhaftender Gelatine, mit Hülfe eines Tröpfchens reinen Wassers in recht dünner Schicht mittels des Platindrahtes auf dem absolut sauberen Deckglase •^) ausgebreitet. Man lässt die Schicht luft- trocken werden und fixirt das Präparat in der gewöhnlichen Weise, indem 1) Beitr. z. Biol. d. Pfl. Bd. 2. 1877. p. 419. ") cf. hierzu p. 79, Anm. 1. 3) Centralbl. f. Bakt. Bd. 6. 1889. No. 8/9. *) Centralbl. f. Bakt. Bd. 7. 1890. No. 20. '") Am besten erreicht man diese Beschaffenheit des Deckglases, wenn man, wie bereits oben (p. 50, Anm. 2) angegeben, das mit Alcohol abgeputzte und dann getrocknete Deckglas in der Flamme stark erhitzt. Nach dem Erkalten kann es dann benutzt werden. IV. Allgemeine Methodik der Bakterienbeobachtung. 81 man es drei Mal durch die Flamme zieht (p. 63). Zu starkes Erhitzen hat man hierbei sorgfältig zu vermeiden. Darauf filtrirt man auf das mit einer Pincette horizontal gehaltene Deckglas so viel einer (weiter- hin noch zu besprechenden) Beizflüssigkeit auf, dass das ganze Gläschen davon bedeckt ist, und lässt diese Flüssigkeit kurze Zeit (^/.2 bis 1 Mnute) auf das Bakterienmaterial einwirken. ^) Dann spült man mit reinem Wasser (am besten unter dem dünnen Strahle der Wasserleitung) das Deckgiäschen sorgfältigst ab. Nun bläst man das an der Schicht noch anhaftende Wasser heruntör (cf. p. 68) und trocknet das Grläschen in der gewöhnhchen Weise, als ob man es in Balsam ein- schliessen wollte. Darauf fasst man das Gläschen wiederum mit der Pin- cette und bringt einige Tropfen einer passenden-) Farblösung auf die zu färbende Schicht. Es folgt leichte Erwärmung über der Flamme (bis die Farblösung Dämpfe zu entwickeln beginnt); nach mehreren Minuten spült man die Farbflüssigkeit mit AVasser sorgfältig ab, trocknet das Präparat in gewohnter Weise und schliesst es in Xylolbalsam ein. Zur Herstellung der Beize löst man (unter Erwärmen) 2 g Tannin in 8 ccm Wasser und setzt der Lösung 5 ccm einer kalt gesättigten wässerigen Ferrosulfat- (Eisenvitriol-) Lösung und 1 ccm einer gesättigten alcohoHschen Fuchsinlösung hinzu. Nach dem Um- schütteln ist die Beizflüssigkeit ohne Weiteres"') gebrauchsfähig, und ') Loeffler hat angegeben, dass die Beize unter massiger Erwärmung einwirken soll: Man hält das Deckglas in einiger Entfernung über die Flamme, bis die Flüssigkeit schwach zu dampfen beginnt. Nach meinen Erfahrungen kann man die Erwärmung der Beize völlig entbehren. Die bei Zimmertemperatur ein- wirkende Beize giebt eben so gute Eesultate wie die ganz massig erwärmte. Auf jeden Fall hat mail sich vor zu starker Erhitzung der Beize auf das Sorgfältigste zu hüten, weil sonst die Präparate unweigerhch verdorben werden. ') Vergl. die über diesen Punkt im Text oben weiter folgenden Bemerkungen. ^) Loeffler (1. c.) hat angegeben, dass die so bereitete Beize wohl für manche Bakterienarten ohne Weiteres zu gebrauchen sei, dass aber die meisten Arten noch eines Zusatzes zur Beize bedürften, der die chemische Eeaction der letz- teren verändert: einzelne Ai-ten erforderten eine sauer reagirende Beize, andere eine alkalisch reagirende, damit ihre Geissein fähig würden Anihnfarbstotfe aufzunehmen. Ich habe mich von der Stichhaltigkeit dieser Forderung nicht überzeugen köimen. Es scheint mir auf die Eeaction der Beize nicht in der von Loeffler ausgesprochenen Weise anzukommen. An den nach Loeffler so ausserordentlich empfindlichen Typhusbacillen z. B., behufs deren Geisseharbung ein ganz bestimmter, tropfenweise abgestimmter Zusatz von 1 proc. Natronlauge zur Beize nothwendig sein sollte, gelang es mir (3. Aufl. dieses Buches. 1893. p. 76) ohne Weiteres mit einer durch Schwefel- säure kräftig angesäuerten Beize die Geissein darzustellen. Auch Luksch (Centralbl. f. Bakt. Bd. 12. 1892. p. 430) hat diese Erfahrung gemacht. Offenbar kommt es zum GeHngen der Geisseifärbung im Allgemeinen auf andere Dinge viel mehr an als auf die Eeaction der Beize. (Siehe oben im Text weiter.) Günther, Bakteriologie. 4. Auflage. (i 82 A. Allgeraeines. sie hält sich dann "Wochen und Monate lang in diesem gehranchs- fähigen Zustande. ^) Damit die Geisseifärbung nach der geschilderten Methode gelingt, hat man noch eine Eeihe von wesentlichen Punkten zu beachten. Der wichtigste, allerwesentlichste Punkt, auf den es zum Gelingen der Geisseifärbung ankommt, ist die passende Beschaffenheit des Bakterienmaterials. Wenn wir eine eigenbewegiiche Bakterien- art cultinren und die Cultm* in verschiedenen Stadien ihres AVachs- thums untersuchen, so finden wir durchgehend, dass die Bakterienzellen, so lange die Cultur noch sehr jung ist, mehr oder weniger lebhafte Eigenbewegung zeigen, und dass mit zunehmendem Alter der Cultur diese Eigenbewegung allmähhch träger wird. Femer bemerkt man, dass in der ganz jungen Cultur die Eigenbewegung ein Attribut aller oder der meisten Zellen ist, während bei dem Aelterwerden der Cultur all- mählich immer mehr und mehr Zellen die Eigenbewegiichkeit verlieren und dann nur noch hier und da einzelne Zellen diese Eigenbewegung darbieten. Schliesslich kommt dann ein Zeitpunkt, wo die Eigenbewegung überhaupt völhg erloschen ist. Das braucht aber durchaus noch nicht zu bedeuten, dass die Cultur abgestorben ist. Ohne Zweifel handelt es sich hier nur um die ersten Zeichen der Degeneration; eine Ueber- tragung auf fiischen Nährboden hat in diesem Zeitpunkte gewöhnlich wieder die Entwickelung einer frischen, lebenskräftigen, eigenbewegiichen Cultur zur Folge. Für das praktische Vorgehen bei der Herstellung eines Geisseipräparates ergiebt sich aus dem Vorhergehenden, dass es ausserordentUch darauf ankommt, in welchem Zeitpunlrte eine bestimmte Cultur zm- Präparation verwendet wird. Denn wir werden nur dann erwarten dürfen, im mikroskopischen Präparate die Geisseifäden gut zu Gesicht zu bekommen, wenn dieselben überhaupt in lebenskräftigem Zustande vorhanden sind. Bestimmte a 1 1 g e m e i n e Vorschriften lassen sich bezüglich des für die Präparation passenden Zeitpunktes nicht geben: denn die eine Bakterienart wächst (ceteris paribus) schneller als die andere ; bei der ersteren werden degenerative Zustände also auch früher eintreten als bei der letzteren. Es giebt aber ein sehr einfaches ^) Bunge (Fortschr. d. Med. 1S94. No. 12, 17, 24) hat (im Institut von Eberth) die Loeffler'sche Beize in folgender Weise modificirt: Er vermischt 3 Theile gesättigter wässeriger Tanninlösung mit 1 Theil einer wässerigen Ver- dünnung (1:20) von Liquor ferri sesquichlor. Zu je 10 ccm der Mischung giebt er 1 ccm einer gesättigten wässerigen Fuchsinlösung. Zu einem kleinen Quantum der (einige Tage alten) Flüssigkeit werden (1. c. p. 933) einige Tropfen Wasserstofl- superoxydlösung gegeben bis zur Eothbraunfärbuug. Die so fertig gestellte Beize wird gut umgeschüttelt und dann auf die Präparate filtrirt. IV. Allgemeine Methodik der Bakterienbeobachtung. 83 Mittel, sich davon zu überzeugen, ob eine vorliegende Cultur momentan für die Präparation der Geisseifäden geeignet ist, d. h. ob sie gerade jetzt lebenskräftige Geissein aufweist: die Untersuchung des Materials im hängenden Tropfen. Finden wir hierbei die Bakterien in frischer, lebendiger Bewegung, so ist das ein Zeichen dafür, dass lebenski'äftige Geissein vorhanden sind; ist die Bewegung eine matte und träge, so sind bereits degenerative Zustände vorhanden, und wir brauchen in diesem Falle gar nicht erst den Versuch der Geisseifärbung zu machen. Im Allgemeinen eignen sich also, wie aus dem Gesagten hervorgeht, möglichst junge Cultur en relativ am besten für die Darstellimg der Geisseifäden. Ferner ist, wie ich gefunden habe, auch das Alter des zur Herstellung der Cultur benutzten Nährbodens nicht gleich- gültig: Je älter der Nährboden, d. h. je mehr eingetrocknet derselbe ist, desto weniger energisch ist (ceteris paribus) das Wachsthum der darauf ausgesäeten Bakterien, desto weniger lebensln-äftig verhalten sich die einzelnen Individuen. Die zu benutzenden Nährböden sollen also möglichst frisch hergestellt sein. Ein zweiter wichtiger Punkt, auf den übrigens Loeffler gleich von Anfang an hingewiesen hat, ist der, dass das Bakterienmaterial in möglichst dünner Schicht und in möglichst reinem Zustande auf dem Deckglase ausgebreitet wird. Anhaftende schleimige oder eiweissartige Beimengungen, anhaftende Gelatine etc. färben sich stets mit und machen dadurch die Präparate unbrauchbar. Aus diesem Grunde empfiehlt es sich gewöhnlich nicht, das Material aus Gelatine- culturen zu entnehmen. Auch Bouillonculturen sind nicht zu gebrauchen, wenn man saubere Präparate hal)en will. Dagegen eignen sich vortrefflich Agar-Oberflächenculturen; das Material lässt sich von diesen leicht ohne Verletzung des Nährbodens entnehmen, und man bekommt hier die Bakterienzellen so rein, wie es überhaupt möglich ist. Was die Wahl der Farblösung angeht, die man nach der Beizung des Materials anzuwenden hat, so ist im Allgemeinen zu sagen, dass sich unsere kemßirbenden Anilinfarbstoffe sämmtlich zur Geissei- färbung benutzen lassen, und dass auch alle Lösungen dieser Farb- stoffe, die man sonst für die Zwecke der Kern- (resp. Bakterien-) Färbung anwendet, ^ ) zum Zwecke der Geisseifärbung zu gebrauchen sind. Man wird natürlich in jedem Falle, wenn man zwischen zwei Farblösvmgen zu wählen hat, der intensiver färbenden den Vorzug geben. Loeffler hat als besonders geeignet für den vorliegenden Zweck gesättigte Lösungen der Violette (cf. p. 66j oder des Fuchsins in ') cf. weiter hinten ' Abschnitt IV, 5. G* 84: ^^- Allgemeines. xlnilinwasser^) empfohlen. Ich finde, dass sich auch die gewöhn- lichen wässerig-alcoholischen Farbstofflösungen (cf. oben p. 66), sofern sie nur ganz frisch hergestellt sind, vor- trefflich für die Färbung der Geisseifäden eignen. Die besten Resul- tate bekam ich stets mit der mit Fuchsin hergestellten Lösung.-) Fassen wir das über die Loeffler'sche Greisseifärbung Gesagte in der Form eines kurzen Eeceptes zusammen, so würde sich die Herstellung eines Geisseipräparates in folgender Weise gestalten : 1) Das event. zu benutzende Material (welches am besten von ganz jungen Agar - Oberflächenculturen , die auf frisch hergestelltem Nährboden angelegt wurden, entnommen wird) wird im hängenden Tropfen geprüft. (Nur im Falle vorhandener lebhafter Beweglichkeit der Bakterienzellen eig-net sich dasselbe für die Geisseifärbung.) 2) Das bei der Untersuchung im hängenden Tropfen als geeignet befundene Material wird in möglichst dünner Schicht und in möglichst reinem Zustande (cf. oben p. 83) auf dem absolut sauberen Deck- glase (cf. oben p. 50, Anm. 2) ausgebreitet. Man geht hierzu, falls es sich um eine A g a r r e i n c u 1 1 u r handelt, am besten so vor, dass man auf das Deckglas mit Hülfe des Platindrahtes oder der Platinöse zu- nächst ein kleines Tröpfchen frischen, reinen Leitungswassers giebt. Li das Tröpfchen hinein tupft man (unter einmaliger kurzer Berührung) die Spitze des mit dem Bakterienmaterial versehenen Platindrahtes. Man glüht den am Drahte hängen gebliebenen Bakterienüberschuss aus, lässt den Draht erkalten und benutzt ihn dann zum Ausbreiten der Bakteriensuspension auf dem Deckglase (cf. p. 62). Handelt es sich nicht um Eeinculturen, sondern um b a k t e r i e n h a 1 1 i g e I n f u s e , die man präpariren will, so ist die Verdünnung des Materials mit Wasser gewöhnlich überflüssig. 3) Man lässt das Material antrocknen und fixirt das Präparat, ^) Die Darstellung des Anilinwassers ist weiter unten in Abschnitt IV, 5 beschrieben. Zu 100 ccm Anilin wasser giebt man 4 — 5 g des gepulverten Farb- stoffes. Man schüttelt dann öfters um und erhält so in kurzer Zeit die gewünschte Farblösung. Eventuell kann man zu der letzteren noch eine geringe Menge Natron- lauge (1:1000) zufügen. — Beim Gebrauche werden diese Lösungen, da sie dazu neigen, ,, Farbstoffniederschläge" (cf oben p. 66) auf die Präparate ausfallen zu lassen, auf die letzteren auffiltrirt. ") Das Fuchsin (crystallisirtes salzsaures Eosanüin) ist ein sQhr reiner, stets in derselben gleichmässigen Beschaffenheit im Handel zu habender Farbstoff. Anders verhalten sich die Violette, welche in den verschiedensten Sorten vorkommen ; ich habe gelegentlich Proben angetroffen, bei deren Anwendung gute Geisseifärbung überhaupt nicht zu bekommen war. IV. AUgemoinc Methodik der Bakterienbeobachtung. 85 indem man es (nnter Vermeidung zn starker Erhitzung [cf. oben p. 81]) drei Mal durch die Flamme zieht. 4) Man tiltrirt einige Tropfen der Loeffl er 'sehen Beize (cf. oben p. 81) auf das horizontal gehaltene Deckglaspräparat und lässt die Beize 1/2 ^^i^ ^ Minute einwirken. Erwärmung ist hierbei nicht nöthig, event. sogar schädlich {cf. p. 81, Anm. 1). 5) Man spült die Beize, am besten mit dem dünnen Strahle der Wasserleitung, sorgfältig ab und trocknet das Präparat in der gewöhn- lichen Weise durch Abblasen etc. (cf. oben p. 68). 6) Entweder: Man filtrirt einige Tropfen einer gesättigten Lösung von Violett oder Fuchsin in Anilinwasser (cf. oben p. 84, Anm. 1) auf das horizontal gehaltene Deckgiaspräparat oder: Man giebt mit Hülfe der Pipette (ohne Filtration) einige Ti"opfen einer fiisch hergestellten wässerig-alcoholischen Fuchsinlösung (cf. p. 84) auf das Deckglas und ei'wärmt das letztere dann über einer Flamme massig bis zu be- ginnender Dampfbildung. Man lässt die warme Farblösung noch c. 1 Minute einwirken und spült sie dann mit Wasser sorgfältig ab. 7) Man trocknet das Präparat schnell und schliesst es in Xylol- balsam ein. Nach der geschilderten Methode sind die Präparate gefärbt, welche den Photogramnien Taf. III, Fig. 16 (Spirillum Undula mit Geissei- büscheln), Taf. ni, Fig. 17 (grosse Bacillen mit Geisseibüscheln). Taf. ni, Fig. 18 (grosse Vibrionen mit Geissein), Taf. Vni, Fig. 46 (Typhusbacillen mit Geissein), Taf. X, Mg. 57 (Choleravibrionen mit Geissein) zu Grunde liegen. Zu bemerken ist, dass die geschilderte Loeffler'sche Geissel- färbungsmethode, wenn man auch alle von uns erörterten Cautelen be- rücksichtigt, sich in der Praxis immerhin als ein difficiles, in den Resultaten nicht ganz sicheres Verfahren darstellt. Vor Allem gelingt es nur ganz ausnahmsweise, ein Präparat so herzustellen, dass alle einzelnen Stellen desselben das durchmusternde Auge befriedigen; auf der anderen Seite ist es allerdings ebenfalls eine Seltenheit, dass ein sorgfältig hergestelltes Präparat gar keine „guten Stellen" enthält. Die Loeffler'sche Geisselfärbungsmethode färbt nicht nur die Geissein der Bakterien und ihren Protoplasmakörper, sondern sie färbt überhaupt die gesammte Bakterienzelle in allen ihren einzelnen Theilen. Während bei der gewöhnlichen Behandlung der Präparate mit basischen Anilinfarbstoffen nur der Protoplasmakörper (der Kern) der Bakterienzelle gefärbt wird, die Hülle nur in seltenen Fällen ganz leichte Färbung annimmt, so tingirt sich bei der Behandlung mit der 86 A. Allgemeines. Loeffler' sehen Methode stets auch die Membran, die Hülle der Bak- terienzelle, und zwar meist (aber nicht immer) in gleich intensiver Weise wie der Protoplasmakörper. Ist bei einem bestimmten Bakterien- material die Färbung von Hülle und Protoplasmakörper gleich intensiv ausgefallen, so resultiren füi- das Auge dickere Bakterienzellen, als sie erhalten werden, wenn das Material mit den einfachen, gewöhnhchen Färbungsmethoden behandelt wird. (Eine Illustration des Gesagten giebt ein Vergleich der Figuren 55 und 57 auf Taf X. In Fig. 55 haben wir CholeraA-ibrionen , welche einfach mit Fuchsin gefärbt sind. Hier ist also nur der Protoplasmakörper, der Kern der einzelnen Zellen gefärbt. In Fig. 57 haben wir dieselben Organismen, nach der L ef f 1er' sehen Geisselfärbungsmethode behandelt: hier ist die Hülle mitgefärbt. Dieselben Organismen erscheinen in Fig. 57 also dicker als in Fig. 55.) Häufig findet man aber, dass die Hülle der Bakterien- zellen bei der Loeff er 'sehen Geisselfärbungsbehandlung sich nicht mit gleicher Intensität vne der Protoplasmakörper, sondern erheblich schwächer färbt. Man erhält in solchen Fällen oft ausserordentlich schöne, die Hülle von dem Kern der Bakterienzellen dif- ferenzirende, Bilder. Eine von der Loeffl er 'sehen im Prineip verschiedene Methode der Darstellung der Geisseifäden hat (1893) van Erm engem ^) an- gegeben. 4. Beobachtung der Bakterien in Schnitten. Allgemeines über Schnittbehandlung. Will man Bakterien in Schnitten thierisehen Gewebes zur Darstellung bringen, so werden die Schnitte am besten gewissen Methoden der Färbung unterworfen. Wie wir sehen werden, gelingt es so stets, im Gewebe vorhandene Bakterien nachzuweisen. Un- gefärbt lassen sieh die Bakterien in Schnitten nur sehr schwer naeh- *) Travaux du laboratoire d'hygione et de bacteriol. de l'üniversite de Gand. t. 1. 1S93; ref. Centralbl. f. Bakt. ' Bd. 15. p. 969. — Diese Methode behandelt das Material zunächst mit einer Beize, welche Osmiumsäure und Tannin enthält („Bain fixateur") , dann, nach Spülung mit Wasser und Alcohol, mit schwacher Silbernitratlösung („Bain sensibilisateur") , darauf, ohne vorherige Abspülung, mit einer Lösung von Gallussäure, Tannin und Kaliumacetat („Bain reducteur et ren- for^ateur"), endlich wiederum mit Silbernitratlösung; schliesslich werden die Präparate abgespült, getrocknet und in Balsam eingeschlossen. Die Geissein färben sich bei dieser Behandlung dunkelbraun. (Nähere Details siehe an der citirten Stelle.) IV. Allgemeine Methodik der Bakterienbeobacbtung. 87 weisen. Die Bakterien sind im natürlichen Zustande ebenso ungefärbt wie die Gewebstheile; durch die Contouren der letzteren werden die Contouren der Bakterien verdeckt, und es gelingt, auch bei den grössten Formen, nie, in einem ungefärbten Schnitte Bakterien zu sehen, ohne dass derselbe eingreifenden Proceduren durch Einwirkung besonderer Reagentien unterworfen wird. Die Bakterien sind mm im Gegensatz zu dem thierischen Gewebe durch eine erhebliche Resistenz gegen Säuren u n d A 1 k a 1 i e n ausgezeichnet, und man kann daher dadurch, dass man die Schnitte mit derartigen Reagentien behandelt, d. h. dass man die Gewebstheile mehr oder weniger zer- stört, Bakterien zu sehen bekommen. Am besten eignet sich als Reagenz verdünnte Kalilauge, in der der Schnitt (unter dem Deckglase) stark erwärmt wird. Die Gewebstheile werden hierbei zer- stört, die Bakterien treten hervor. Immerhin sind diese Manipulationen umständlich und führen doch nur sehr bedingungsweise zu einem Resultat. Man kann auf solche Weise wohl grosse Formen (z. B. Milz- brandbacillen) sichtbar machen, auch grosse zusammenhängende Mikro- coccenhaufen zur Darstellung bringen; aber „manche, namentlich sehr kleine Bakterien werden durch diese Reagentien ebenso zerstört oder verändert wie die thierischen Gewebe, und auch in letzteren finden sich oft unbestimmbare Körnchen, die durch Säuren und Alkalien nicht beseitigt werden" (R. Koch^)). Ausserdem macht die bei den ge- nannten Proceduren unvermeidliche Schädigung des Gewebes eine Beurtheilung der Lageverhältnisse der Bakterien im Gewebe voll- ständig unmöglich. Man wird daher, wenn es sich um den Nachweis von Bakterien in Schnitten handelt, stets die F ä r b u n g der Bakterien in Anwendung bringen müssen. Die Schnitte stellt man sich am besten mit Hülfe des Mikro- toms (cf. p. 51) her. Um die Organe m schnittfähige Con- sistenz zu bringen, überträgt man dieselben, am besten in nicht zu grossen Stücken, aus der Leiche etc. direct in absoluten Alcohol, welcher fast ausschliesslich zur Härtung für unsere Zwecke benutzt wird. Der absolute Alcohol ist ein ausserordenthch wassergieriger, hygroskopischer Körper. Er extrahirt aus den Organen das Wasser, bringt die Theile zum Schrumpfen und verleiht ihnen dabei eine derbere Consistenz (härtet sie). Das extrahirte Wasser resp. der in der Um- gebung der eingelegten Organstücke sich bildende wasserreiche Alcohol ^) Untersuchungen über die Aetiologie der Wundinfections-Krankheiten. Leipzig. 1S7S. p. 29. gg A. Allgemeines. ist mm specifisch erheblich schwerer als der al)solute Alcuhol und sinkt infolgedessen in dem Härtungsgefässe zu Boden. Um das zu härtende Stück dauernd unter dem Einflüsse absoluten Alcohols zu belassen, muss man dasselbe also in die oberen Schichten des Alcohols placii-en. Man hält es hier fest am besten durch schwim- mende Korkstücke, an deren unterer Seite das zu härtende Stück mit Hülfe von Stecknadeln festgesteckt wii'd, oder man bringt in die unteren Partien des Alcohols resp. auf den Boden des Gefässes zu- nächst einen grösseren Bausch Fliesspapier, auf welchem dann das zu härtende Stück ruht.^) Ist das zu untersuchende Organ entwässert (gehärtet), so schneidet man sich kleine Stücke von etwa 5 mm Höhe und 1 qcm Grundfläche davon mit scharfem Messer ab, die nun auf die glatte Querschnittfläche eines Flaschenkorkes aufgeklebt werden. Das Aufkleben geschieht bequem mit einer dicken wässerigen Lösung von Gummi arabicum. Man verfährt dabei so, dass man das auf- zuklebende Stück zunächst etwa eine halbe ]\Iinute an der Luft liegen lässt, um den oberflächlich anhaftenden Alcohol verdunsten zu lassen, imd dass man es dann mit der Pincette fasst und es mit einer der (getrockneten) Breitseiten in einen Ti'opfen der Gmnmilösung, welchen man auf der Korkfläche ausgebreitet hat, hmeindrückt. Man giesst dann zunächst einige Tropfen Alcohol über das gesammte aufgeklebte Stück, Avelche an den Seiten desselben abfliessen und die äusseren . Partien der hervorgequollenen Gummilösung durch Wasserentziehung erhärten. Dadurch wird es dann ermöglicht, den Kork in umgekehrter Lage '(das aufgeklebte Stück nach unten) in ein Gefäss mit absolutem Alcohol zu übertragen, ohne dass das Stück sich vom Korke loslöst. In dem Alcohol wird dasselbe dann belassen, bis das Wasser aus allen Theilen der Gimimilösung entfernt ist, was in zwei bis sechs Stimden der Fall ist. Dann ist zwischen dem aufgeklebten Stücke und dem Korke eine sehr feste, steinharte Verbindung hergestellt ; und der Kork kann nun in der Ivlenmie des Mikrotoms fest eingespannt werden, das aufgeklebte Stück kann (unter Benetzung des Messers mit absolutem ^) Unter Umständen kann man auch ohne vorhergehende Alcoholhärtung Mikro- tomschnitte herstellen, die sich für nachfolgende Fäi-bungsbehandlung eignen. So ge^vinnt W. D. Miller (Verhandlungen der Deutschen Odontolog. Gesellsch. Bd. 6. 1894. — cf. auch Centralbl. f. Bakt. Bd. 16. p. 450) aus frischen erkrankten Zahnpulpen Schnitte mit HüKe des Gefrier mikrotoms. Die einzelnen, zarten Schnitte werden, auf einem 6—8 mm dicken Glasstabe ruhend, zunächst in 30proc., dann in 50-, 70 proc, schliesslich in absoluten Alcohol gebracht und können dann, immer auf dem Glasstabe ruhend, beliebigen Färbungsproceduren unterworfen werden. IV. Allgemeine Methodik der Bakterienljeobacbtuiig. 89 AlcühoiJ gescliuitten werden. Man hat hierbei daranf zu achten, dass die Schärfe des Messers nicht mit den harten Gunmiitheilen in Collision geräth, da sie sonst leiden würde. Hervorgequollene Gmnmitheile müssen, deshalb (mit einem Messer) vor dem Mikrotomiren entfernt werden. Statt des Gummi arabicum kann auch Fischleim zur Auf- klebung der Organstücke auf Kork genommen werden. C. Fraenkel') empfiehlt zu dem Zwecke eine JVIischung von 1 Gelatine, 2 "Wasser, 4 Gljcerin. Will man dünne Objecte, die sich nicht zum Aufkleben eignen (z. B. Darm), mit dem Mkrotom zerlegen, so empfiehlt es sich, die- selben zwischen Stücken von gut gehärteter Ani^doidleber zu placiren und mit diesen in die Klammer des Mikrotoms einzuspannen. Die Leber wdrd dann mit dem Darm etc. zugleich geschnitten. Für Gewebe, welche Hohlräume enthalten und sich deshalb an und für sich weniger gut zum Zerlegen in zusammenhängende Schnitte eignen, kann man mit Vortheil die Schiefferdecker'sche Celloidinmethode-) anwenden. Man härtet zu dem Zwecke die kleinen, zurechtgeschnittenen Stücke erst gut in absolutem Alcohol und bringt sie dann aus dem letzteren in eine dicke Celloidinlösung (das Celloidin ist ein collodiumähnlicher Körper, welcher sich in absolutem Alcohol sowohl wie in einer Mischung von Alcohol und Aether löst). Hier bleiben die Stücke einen bis mehrere Tage bis zur völligen Durch- tränkung mit der Celloidinlösmig. Sie werden dann mit der Pincette herausgenommen und, mit einer Schicht der dicken Lösung noch um- hüllt, mit Hülfe der letzteren direct auf die Korkfläche geklebt. Xach einigen Mnuten kommt das Präparat mit dem Kork in 60proc. Alcohol, in welchem es Avieder einen bis mehrere Tage verbleibt. Hier nimmt das Celloidin und mit ihm das ganze Präparat Schnittconsistenz an. Dann wird der Kork, wie oben angegeben, eingespannt, und das Prä- parat lässt sich nun mit dem Mkrotom (unter Benetzung des Messers mit 60proc. Alcohol) sehr schön in zusammenhängende Schnitte zer- legen. Jeder der Schnitte ist von einem „Celloidinmantel" umhüllt, die Hohlräume des Schnittes Averden ebenfalls von Celloidin ausgefällt. Das Celloidin bleibt dann während der folgenden Färbung etc. mit dem Schnitte in stetiger Verbindung. Das Celloidin färlit sich mit Anilin- farben. Zimi Herstellen feinster Schnitte, die allerdings zum Zwecke der ^) Grundriss d. Bakterienk. 3. Aufl. 1S90. p -) Arcb. f. Anat. 1SS2. 90 A. Allgemeines. Untersuchung des Gewebes auf Bakterien kaum je nöthig werden dürften, muss man die Organe in Paraffin einbetten. Es ist aber, um an den Paraffinschnitten eine Bakterienfärbung vornehmen zu können, durchaus nothwendig, das Paraffin zunächst (dm'ch Xylol) vollständig zu entfernen und die Schnitte dann durch Alcohol (zur Extrahirung des Xvlols) gehen zu lassen. Nur in den seltensten Eällen dürfte aber, wie gesagt, die Anwendung der Paraffinmethode für unsere Zwecke nöthig werden. Dünner als 0,02 mm braucht man die jMikrotomschnitte föi* Bak- terienuntersuchungen nicht zu machen; derartige Schnitte lassen sich bei guter Härtung des Objectes und bei gutem Zustande des Messers stets erreichen. Aber auch mit dickeren Schnitten (0,03 — 0,05 mm) kann man oft noch auskommen. Während des Schneidens wird (bei den mit Gummi oder Gelatine aufgeklebten und bei den zwischen Amyloidleberstücken eingeklemmten Organen) das Mkrotommesser stets mit absolutem Alcohol befeuchtet erhalten. Die Schnitte werden mit einem Pinsel von der Klinge herunter genommen und in ein Schälchen mit absolutem Alcohol übertragen. Um die Schnitte nun zu färben, brmgt man sie zunächst auf kurze Zeit in Wasser, von da in die Earblösung. Als Earbflüssig- keiten kann man alle jene Flüssigkeiten verwenden, die wir oben (p. 66) zur Färbung des Trockenpräparates verwandt haben. Wir müssen nur stets darauf sehen, dass wir eine wässerige resp. stark wasserhaltige Flüssigkeit zur Anwendung bringen. Besonders zu empfehlen ist für Schnittpräparate die Loeffler'sche alkalische Methylenblaulösung, ^) ein Gemisch von 30 ccm gesättigter alcoholischer Meth3'lenblaulösung und 100 ccm wässeriger Kalihydratlösung (1:10 000). Die Loeffler'sche Meth^ienblaulösung ist, wie Meth^^lenblaulösungen überhaupt (cf. oben p. 67), dadurch vor anderen Farbflüssigkeiten aus- gezeichnet, dass sie ganz unbeschränkt haltbar und von ganz unveränderlicher Gebrauchsfähigkeit ist. Diese Farblösung soll auf unserem Arbeitstische nie fehlen. Benutzt man (wässerig-alcoholische) Fuchsin- oder Violettlösungen zm- Schnittfärbung, so hat man sorg- fältig darauf zu achten, dass diese Lösungen frisch hergestellt sind; denn sonst läuft man Gefahr, dass sich die Oberfläche des Schnittes mit Farbstoffiiiederschlägen bedeckt (cf. p. 66). Ln ftischen Zustande aber smd die genannten Lösungen ausgezeichnet für Schnittfärbungen zu verwenden. ') Mitth. a. d. Kais. Ges.-Amte. Bd. 2. 1SS4. p. 439. IV. Allgemeine Methodik der Bakterienbeobachtung. 91 Wenn man nun einen Schnitt aus einem thierischen Organ in eine der genannten Farbflüssigkeiten bringt und denselben nach einer Reihe von Minuten wieder herausnimmt und in Wasser abspült, so ^nrd man in der Regel nichts weiter zu sehen bekommen als eine intensiv und gleichmässig gefärbte Masse, in der Details nicht oder kaum zu erkennen sind: das Gewebe hat sich zunächst in allen seinen Theilen mit dem Farbstoffe vollgesogen und beladen. Erst eine weitere Behandlung des Schnittes mit gewissen (weiterhin zu besprechenden) Flüssigkeiten, welche die Fähigkeit haben, den Farbstoff mehr oder weniger aus dem Schnitte zu extrahiren, lässt einzelne gefärbte Partien in dem Präparate vor anderen weniger gefärbten hervortreten. Liesse man solche Flüssigkeiten genügend lange Zeit auf den Schnitt ein- wirken, so würden sie allmählich eine vollständige Entfärbung des Schnittes zu Wege bringen. Lässt man sie aber nur kurze Zeit ein- wirken, überwacht man ihre Wirkung, so erhält man Präparate, in denen nur die Zellkerne und die (cA^entuell vorhandenen) Bak- terien noch gefärbt sind, während die Intercellularsubstanz und auch das Zellprotoplasma wieder entfärbt sind. Man findet so, dass die verschiedenen Bestandtheile, aus denen sich das thierische Gewebe zusammensetzt, keine principi eilen Unterschiede in dem Verhalten gegen die basischen Anilinfarbstoffe zeigen. Nicht der eine Bestandtheil wird gefärbt, während der andere der Färbung widersteht; wohl aber bestehen quantitative Unter- schiede in der Färbbarkeit der einzelnen Componenten des Gewebes, die sich darin äussern, dass, bei einem bestimmten Grade der Ein- wirkung farbstoffextrahirender Flüssigkeiten, unter den ursprünglich gleichmässig gefärbten verschiedenen Bestandtheilen der eine den auf- genommenen Farbstoff noch festhält, während ein anderer ihn voll- ständig oder beinahe vollständig wieder verloren hat. Man kann so die verschiedenen Gewebsbestandtheile in eine Färbbarkeitsscala bringen, welche, wenn man mit denjenigen, die am leichtesten den Farbstoff wieder loslassen, beginnt, sich folgendennassen gestaltet : Intercellularsubstanz, Zellprotoplasma, Zellkerne, Bakterien (wenn sie vorhanden sind). Die farbstoffextrahirenden Flüssigkeiten (als solche kommen be- sonders Säm-en zur Verwendung) bezeichnet man als „Entfär- bungsmittel". Durch sie wird eine „Differenzirung" herbei- geführt, d. h. einzelne Theile (Kerne, Bakterien) des Schnittes treten 92 A. Allgemeines. in isolirter Färbung vor anderen Theilen, die die Färbung verloren haben, hervor. Ist der zuerst diffus gefärbte Schnitt genügend „entfärbt", „differ enzirt", so ist er eigentlich fertig; da wir ihn aber schliess- lich in Canadabalsam zur Conservirung einschliessen wollen, der Balsam sich aber mit irgendwie wasserhaltigen Flüssigkeiten nicht vermischen lässt, so muss zunächst aller und jeder Wassergehalt aus dem Schnitte entfernt werden; und dies geschieht durch Behandlung des Schnittes in absolutem Alcohol. Der Schnitt macht also noch ein Mal eine Entwässerung oder Härtung durch. Aber auch mit Alcohol lässt sich Balsam nicht mischen. Wir müssen deshalb den Schnitt aus dem Alcohol in eine Flüssigkeit bringen, welche auf der einen Seite die Fähigkeit hat, sich mit Alcohol zu vermischen, auf der anderen Seite aber sich auch mit Canadabalsam resp. dem von uns stets angewandten Xylol-Balsam (cf. p. 69) mischt. Derartige Körper (auch „Aufhellungsmittel" genannt) giebt es nun eine ganze Keihe. Besonders ölige Flüssigkeiten sind mit den ge- wünschten Eigenschaften ausgestattet. Am meisten verwandte man fi-üher das Nelkenöl zu diesem Zwecke, aber auch Terpentinöl, Cedern-, Origanum-, Zinimet-, Bergamott-, Anis-Oel, Phenol, Anilin^) waren und sind hierzu im Gebrauch. Ich möchte für imsere Zwecke ganz ausschliesslich einen anderen, ebenfalls seit Langem gebräuchlichen, Körper empfehlen: das Xylol (cf. p. 69). Das Xylol ist ein Köi^jer, der sich gegen mit basischen Anilinfarben gefärbte Kerne und Bakterien vollständig indifferent verhält und sich in dieser Hinsicht sehr rühmlich von verschiedenen der oben ge- nannten Flüssigkeiten, speciell auch von dem Nelkenöl, unterscheidet, und der ohne jeden Eückstand verdunstet und nicht verharzt und schmiert, wie es z. B. ebenfalls das Nelkenöl thut. Wir behandeln den gefärbten, dann „entfärbten" und entwässerten Schnitt also mit Xylol. Mit dem Xylol durchtränkt sich der Schnitt sehr schnell, und er wird dann mit Hülfe eines Spatels auf die Glitte des reingeputzten b j e c 1 1 r ä g e r s übertragen. Nachdem das überschüssige Xylol von dem Schnitte durch vierfach zusammengefaltetes Fliesspapier, welches man in Berührung mit dem ^) Das Phenol und das Anilin haben auch die Fähigkeit, geringe Mengen Wassers aufzulösen. Bei der (weiterhin noch zu besprechenden) Gram-Weigert'- schen Methode Avird das Anilin als Entwässerungsmittel verwandt. Dem Xylol kommt, wie gegentheiUgen , gelegentlich zu findenden Angaben gegenüber hier aus- drücklich bemerkt sein mag, irgend welche Fähigkeit, Wasser aufzunehmen, nicht zu. Der Schnitt wird aus ei- nem Uhr- schälchen in das andere mit der Na- del über- trafen. IV. Allgemeine Methodik der Bakterienbeobacbtung. 93 Schuittrand gebracht hat, abgesogen ist, wird ein Tropfen Balsam (Xylol-Balsam ; cf. p. 69) auf den Schnitt gebracht, auf diesen mit der Pincette (cf. p. 69) das Deckglas gelegt, unter welchem sich dann der Balsam ausbreitet.^) Will man eine genaue Vorschrift für die praktische Ausführung des geschilderten Verfahrens der Schnittfärbung und -Conservirung (welches übrigens im Principe mit dem alten Weigert' sehen Ver- fahren-) völlig übereinstimmt) haben, so wird man eine solche in folgendem Schema finden : 1. Uebertragen der Schnitte aus Alcohol in Wasser für 1 Minute. 2. In eine passend zusammengesetzte (cf. p. 90) Farblösung 2—5 Minuten. 3. Wasser 5 Minuten. 4. Dünne Essigsäure (etwa 1 : lOOO'^)) l Minute. 5. Absoluter Alcohol (Schnitt gut ausbreiten!) ^o Minute. 6. Absoluter Alcohol ^-2 J^Jjn^^te. 7. Xylol Vo dünnte. 8. Uebertragen auf den Objectträger mit dem Spatel. 9. Abtupfen mit Fliesspapier. 10. Aufbringen eines Tropfens Xylol-Balsam. 11. Auflegen des Deckglases (mit der Pincette). Zu diesem Schema ist noch zu bemerken: Wir benutzen zur Aufnahme unserer Flüssigkeiten, in die die Schnitte kommen sollen, am besten Uhrschälchen (cf. oben p. 51). Dieselben kommen stets rein geputzt und trocken zur Anwendung. Die Schnitte übertragen wir stets mit der Nadel aus einer Flüssigkeit in die andere, nicht mit dem Spatel, weil wir möglichst wenig Flüssigkeit mit übertragen wollen. Erst wenn die Schnitte aus dem Xylol auf den Objectträger kommen sollen, benutzen wir den Spatel. Der stumpfwinklig gebogene Spatel (cf. oben p. 51) wird in der linken Hand gehalten und unter den iQ dem Xylol liegenden Schnitt flach hinuntergefiihrt ; man nimmt hier die in der rechten Hand gehaltene Nadel zu Hülfe, mit welcher man den Schnitt auf die Spatelfläche hinaufschiebt. Indem man dann den Schnitt mit Hülfe der Nadel an dem Spatel etwas festdrückt, hebt \) Wie beim Trockenpräparat, so wird man sich natürlich auch hier aus den oben (p. 70) angeführten Gründen hüten müssen , zu viel des Balsams zu nehmen. •2) cf. Virch. Arch. Bd. 84. 1S81. p. 275 ff. 3) Ich halte mir eine etwa 5proc. wässerige Essigsäurelösung vorräthig, von der ich einige Tropfen auf ein Uhrschälchen mit Wasser gebe. 94 A.. Allgemeines. man den Spatel horizontal, d. h. mit dem Schnitte und einer Quantität Xjlol beladen (das man nicht abfliessen lässt), aus der Flüssigkeit heraus und legt ihn sofort auf den Objectträger auf, auf den man nun mit Hülfe der Kadel den Schnitt von dem Spatel hin- überschiebt oder zieht. Die mitübertragene Menge Xylol erleichtert ein glattes Hinübergleiten des Schnittes auf den Objectträger sehr. Bei dem folgenden Abtupfen des Xylols von dem Schnitte muss man darauf sehen, dass der Schnitt nicht etwa zu trocken wird, weil er sonst nach dem Einschlüsse in Balsam Luftblasen einschhesst, die die Beobachtung sehr stören können. Es soll also nur der sichtbare flüssige Ueberschuss des Xylols mit dem Fliesspapier entfernt werden. Den Alcohol giesst man sich in seine Schälchen ein erst unmittel- bar bevor man ihn gebraucht. Der Alcohol ist ein Entwässermigs- mittel. Wir müssen ihn deshalb zmn Gebrauche möglichst wasserfrei haben. Wenn man aber den Alcohol eingiesst imd ihn erst in einer Yiertelstunde benutzt, so hat man keinen Alcohol mehr, sondern ein Gemisch von Alcohol und Wasser, welches letztere der Alcohol aus der Luft angezogen hat, und welches vollständig genügt, um den Alcohol unfähig zu machen, die gewünschte Entwässerung herbei- zuführen. Wenn wir aber den Schnitt in Xylol bringen wollen, so muss er zuvor wirklich völlig wasserfrei gemacht werden: ein Schnitt, der noch Spuren von Wasser enthält, scheidet dieses Wasser im Xylol sofort aus, und diese Wasserausscheidungen, welche dem Schnitt dann dauernd anhaften, machen das schönste Präparat oft unbrauch- bar. Aus diesem Grunde habe ich in dem obigen Schema den Alco- hol auch zwei Mal hinter einander angeführt: die Entwässerung soll vollständig sein. Zum Gelingen einer guten Schnittfärbung ist es stets nothwendig, dass die einzelnen Theile des Schnittes gleichmässig der Einwirkung der verschiedenen Flüssigkeiten ausgesetzt werden. Der Schnitt soll also sowohl in der Farblösung wie in den übrigen Flüssig- keiten möglichst glatt, ohne Falten zu schlagen, liegen. Denn jede Falte bedingt einen ungleichmässigen Zutritt der einwirkenden Flüssig- keit an der gefalteten Stelle und damit auch ein mehr oder weniger unerwünschtes Resultat. Ganz besonders hat man auf eine möglichst glatte Ausbreitung des Schnittes zu sehen in dem Augenblicke, in welchem derselbe aus der Essigsäure in den ersten Alcohol gelangt. Der Schnitt ist hier in den ersten Secunden noch dehnbar und lässt sich mit zwei Nadeln sehr gut glatt ausbreiten. Versäumt man dies aber, lässt man den Schnitt in zufälhg zu Stande gekommener Faltung liegen, so wird er durch den Alcohol in dieser Lage fkii-t und lässt IV. Allgemeine Methodik der Bakterienbeoltachtuug. 95 sich nachher auf keine Weise wieder glatt ausbreiten. ^) D i e F o r m , die der Schnitt in dem ersten Alcohol annimmt, behält er weiterhin unverändert bei. Was bezüghch der Einwirkung der Reagentien auf gefaltete Schnitt- stellen gilt, das gilt natürlich ebenso für Zusammenlagerungen von mehreren Schnitten. Behandelt man eine Anzahl von Schnitten gleichzeitig in demselben Schälchen, so ist es ein Zufall, wenn man gute Resultate erhält; denn die Schnitte lagern sich gern zu- sammen und gestatten den Flüssigkeiten an dieser Stelle mehr, an jener weniger Zutritt. So müssen ungleichmässige Resultate zu Stande kommen. Mau mache es sich deshalb zur Regel, die Schnitte einzeln, individuell zu behandeln. Auch bei Schnitten findet übrigens wie bei Trockenpräparaten (cf. p. 78) die Färbung schneller statt und wird intensiver bei höherer als bei niedrigerer Temperatur. Man darf aber nur ganz massig erhöhte Temperaturen zu Schnittfärbungen verwenden, höchstens Tem- peraturen von 40 — 50^ C. (R. Koch-)). Bei höheren Temperaturen schrumpfen die Schnitte ein mid werden unbrauchbar. Bei den hier geschilderten Methoden der Schnittbehandlung wird der Schnitt behufs der Conservirung in Canadabalsam stets in Alcohol entwässert und gelangt dann durch einen mit Alcohol sowohl wie mit Canadabalsam mischbaren Körper hindurch (Xylol) in den Balsam. Für bestimmte Zwecke (speciell zur Conservirung von Lepraschnitten) hat Unna') eine erheblich abweichende Methode der Schnittbehand- lung angegeben, welche er „Trockenmethode" oder auch „An- trocknungsmethode" genannt hat. Die Schnitte gelangen dabei nach der Färbung und Difierenzirung nicht in Alcohol, sondern in Wasser, werden von hier mit dem Spatel auf den Objectträger über- tragen, mit Fliesspapier abgetrocknet und dann über der Flamme schnell bis zu vollständiger Trockenheit erhitzt. Nach dem Abkühlen wird ^) Streng genommen ist dies nicht ganz richtig. Ein Mittel, einen solchen in gefalteter Lage fixirten Schnitt wieder glatt zu machen, giebt es doch: Man bringt den gefalteten Schnitt aus dem Alcohol wieder in eine wässerige Flüssigkeit resp. in reines Wasser zurück. Er begiebt sich hier, da er mit dem specifisch leich- teren Alcohol getränkt ist, sofort an die Oberfläche und breitet sich gleichzeitig aus: in den allermeisten Fällen bekommt man auf diese einfache Weise einen untadelhaft glatten Schnitt, den man nachher von Neuem zur Entwässerung in Alcohol etc. über- tragen muss. Es ist jedoch zu beachten, dass der Schnitt bei dem geschilderten Zurückbringen in Wasser jedesmal etwas von seiner Färbung verliert. ■') Mitth. a. d. Kais. Ges.-Amte. Bd. 1. 1S81. p. 10. ^) Monatshefte f. praet. Dermatologie. Ergänzungsheft. 1885. — Centralbl. f. Bakt. Bd. 3. 1888. p. 3U. 96 -■^- Allgemeines. mit einem Tropfen Balsam das Deckgiäsclien aufgeldttet. Wir werden Gelegenheit haben, diese für manche Zwecke ganz ausgezeichnete Methode noch zu besprechen. Auch bei der weiterhin noch zu nennenden Weigert' sehen Modification des Gram' sehen Verfahrens wird die Differenzirung und Entwässerung des Schnittes auf dem Objectträger vorgenommen. Was nun die mikroskopische Betrachtung der gefärbten Schnittpräparate angeht, so ist es anzuempfehlen, stets zunächst eine Durchmusterung des Präparates mit schwachem System vor- zunehmen. Xur auf diese Weise wird man unter Umständen etwa vorhandene Bakterien mit Sicherheit auffinden können. Es giebt zwar genuo- Fälle, in denen wir die Bakterien an jeder Stelle des Schnittes antreffen; in anderen Fällen aber treten die Bakterien in einzelnen zerstreuten Herden auf, und diese können, wenn man a priori mit starkem Objectiv untersucht, sehr leicht sich der Auffindung entziehen. Im Uebrigen gelten für die Einstellung des Präparates die oben (p. 59 und 72) bezüglich der Beleuchtung gegebenen Grundsätze : Da es sich um gefärbte Objecte handelt, die wir betrachten wollen, so nehmen wir den vollen Abbe' sehen Condensor; den Trieb des Condensors stellen wir so ein, dass die Beleuchtung maximal ist. Ein nach der angegebenen Methode angefertigtes, gut gelungenes Präparat zeigt Bakterien und Gewebskerne gefärbt, die übrigen Theile mehr oder weniger ungefärbt. Die eigenthümliche Form der Bakterien, ihre Grössenverhältnisse, ihre Gruppirung zu kleineren oder grösseren Verbänden oder Haufen macht eine Verwechselung der Bak- terien mit gefärbten Theilen des thierischen Gewebes kaum möglich. Anlass zu Verwechselungen in dieser Hinsicht haben die von Ehrlich') entdeckten, in normalem und pathologischem Gewebe vorkommenden „Mastzellen" gegeben. Diese Zellen besitzen einen (bei der Fär- bung mit Anilinfarbstoffen ungefärbt bleibenden) Kern, um den herum ein Haufen intensiv färb bar er Körner gruppirt ist. Diese Körner sind häufig für Mikrococcen gehalten worden. „Doch sind die Körnchen gewöhnlich von ungleicher Grösse. Dieses letztere Ver- halten, das Vorhandensein eines Kernes und der Vergleich mit anderen ebensolchen Zellen sichern indessen leicht ihre Diagnose." (Koch.-)) Gelegentlich findet man die Mastzellen auch in Trockenpräparaten (Ausstrichpräparate von Organen); in solchen Präparaten sind die Mastzellen dann häufig zerquetscht, die Körner zexstreut. Derartige ') Arch. f. raikroskop. Anatomie. Bd. 13. 1S77. p. 263. '-) Unters, üb. d. Aetiol. d. Wundinfect.-Krankheiten. Leipzig. 1878. p. 38. IV. Allgemeine Methodik der Bakterienbeobacbtiing. 97 Befunde könnten noch leichter als Mastzellen in Schnitten zur Ver- wechselung mit Mikrococcen Veranlassung geben. Aber auch hier ist nach meinen Erfahrungen die richtige Beurtheilung unter Benutzung der angeführten Kriterien nicht schwer. Selbstverständlich erscheinen bei der mikroskopischen Betrachtung eines jeden Schnittpräparates diejenigen Gewebstheile und speciell auch diejenigen Bakterien dem Auge am besten und klarsten, welche in den obersten Schichten des Schnittes liegen. Für Demonstrations- zwecke, ferner zum Zwecke der photographischen Darstellung etc. wird man möghchst dementsprechend gelegene Stellen auszusuchen haben. 5. Allgemeines über Färbung und Entfärbung. Leicht und sch^ver färbbare und entfärbbare Objecte. In den vorhergehenden Abschnitten haben wir gesehen, dass die Bakterien ganz im Allgemeinen die Eigenschaft haben, aus geeigneten Lösungen basischer Anilinfarbstoffe den Farbstoff aufzunehmen, sich zu färben ; wir sahen weiter, dass dieselbe Eigenschaft auch den Zellkernen des thierischen Gewebes zukommt. Es machte bezüglich des principiellen Vorgehens bei der Färbung auch keine Unterschiede, ob die Bakterien am Deckglase angetrocknet oder ob dieselben im Gewebsschnitt ver- theilt gefärbt werden sollten. Die anzuwendenden Lösungen waren die- selben, und hier wie dort erfolgte die Färbung in kürzester Zeit. Dass Trockenpräparate sich im Allgemeinen schneller färben als Schnitte, liegt nicht etwa an einer principiellen Verschiedenheit der zu färbenden Objecte selbst, sondern nur an der verschiedenen Art der äusserlichen Disponii'ung dieser Objecte. Das Ti'ockenpräparat stellt eine dünne, trockene Schicht dar, welche beim Benetzen mit wässerigen Flüssig- keiten, also auch beim Benetzen mit den Farbstofflösungen, aufquült und sich in dem letzteren Falle begierig mit der Farbstofflösung voll- saugt. Beim Schnitte hingegen haben wir eine grössere Gewebsmasse vor uns, welche mit Alcohol oder Wasser durchtränkt ist. Diese durchtränkenden Flüssigkeiten müssen dann l)eim Einbringen des Schnittes in die Farblösung erst durch Diffusion entfernt werden. Die eigentliche „Färbung" der einzelnen Bakterienzellen erfolgt also, gleichgültig ob ein Schnitt oder ein Trockenpräparat vorhegt, im All- gemeinen in kürzester Zeit — vorausgesetzt, dass man passende Farb- lösungen anwendet. Mehrmals haben wir bereits betont, dass diese Lö- sungen wässerige sein müssen. Es lässt sich nun leicht nachweisen, ^) ^) Diesen (oben im Text folgenden) Nachweis habe ich 1S90 (1. Auflage dieses Buches p. 71) geführt. Güutlier, Bakteriologie 4. Auflage. 7 98 -^- Allgemeines. dass rein alcoholische Lös ii n g eu, d. li. Lösungen der Farb- stoffe in absolutem Alcohol, überhaupt nicht die Spur bakterien- und kernfärbender Eigenschaften haben. Man stelle sich irgend welches Trockenpräparat durch Verreiben von Bakterienmaterial auf dem Deckglase, durch Ausstreichen von Blut, Eiter etc. auf demselben, dar. Man fixire es in der gewöhnlichen Weise. Das absolut trockene Deckglas fasse man mit absolut trockener Pincette und gebe nun auf die angetrocknete Schicht mehrere Tropfen einer gesättigten Lösung eines basischen Anilinfarbstoflfes in absolutem Alcohol. Nach einigen Secunden spüle man das Deckglas mit absolutem Alcohol ab. Die Schicht ist vollständig ungefärbt geblieben. Die Bakterien resp. die Kerne der Eiterzellen etc. haben nicht ver- mocht aus der alcoholischen Lösung Farbstoff aufzunehmen, trotzdem dass diese Lösung procentisch so viel Farbstoff enthält wie keine auf irgend welche sonstige Weise darstellbare Lösung. Ich mll bemerken, dass man, nach dem Aufbringen der Farblösung auf das Präparat, dasselbe, um die Färbung eventuell zu beschleunigen, in die Flamme halten kann, so dass die Farblösung anfängt zu brennen. Entfernt man dann das Präparat aus der Flamme und spült es nach dem Aus- blasen der brennenden Farblösung mit absolutem Alcohol ab, so ist das Resultat dasselbe wie vorher: die Schicht ist ungefärbt gebheben. Nun könnte zwar Jemand einwerfen, durch das Abspülen mit Alcohol, der das beste Lösungsmittel dieser Farbstoffe ist, werde die zu Stande gekommene Färbung vernichtet, der Farbstoff werde wieder extrahirt. Zur Entki'äftung dieses Einwandes stelle man folgenden Versuch an: Ein beliebiges Trockenpräparat färbt man mit der wässe- rigen resp. stark wasserhaltigen Lösung eines basischen Anilinfarbstoffes ; man spült die Lösung darauf mit Wasser ab und macht das Präparat durch Abblasen etc. in der gewöhnlichen Weise trocken, als ob man es in Balsam conserviren wollte. Das Präparat ist jetzt gefärbt. Nun legt man das absolut trockene, mit absolut trockener Pincette gefasste Deckglas in absoluten Alcohol. Der Alcohol wird nicht die Spur von Farbstoff zu extrahii-en vermögen. Erst nach längerem Liegen an der Luft, wenn der Alcohol Wasser aufgenommen hat, beginnt eine ganz leichte, allmählich stärker werdende Extraction des Farbstoffes. Der absolute Alcohol ist unfähig, dem gefärbten Präparate Farbstoff zu entziehen.^) ^) An dieser Stelle möchte ich bemerken , dass (was nach dem Vorstehenden eigentUch selbstverständlich ist) der absolute Alcohol auch aus gefärbten Geissein den Farbstoff nicht zu extrahiren vermag. Wenn man diese IV. Allgemeine Methodik der Bakterienbeobacbtung. 99 Und was von Ti-ockenpräparaten gilt, das gilt von Schnittpräpa- raten ganz ebenso. Nur ist es viel schwerer, sich wirklich absolut trockene Schnitte herzustellen. Ich habe zur Ivlarstellung dieser wich- tigen principiellen Fi-agen Schnitte aus Alcohol mit Hülfe des Spatels auf den Objectträger gebracht. Dort habe ich sie an der Luft an- trocknen lassen und nun noch über der Flamme den Objectträger leicht erwärmt, um möglichst jede Spur h3'groskopisch anhaftenden Wassers zu entfernen. Nach dem Erkalten wurden die Schnitte mit gesättigter, rein alcoholischer Farblösung Übergossen und nach wenigen Secunden mit absolutem Alcohol abgespült. Auch hier derselbe Effect: Ausbleiben jeder Färbung. — Dann habe ich Schnitte in wässerigen Lösungen längere Zeit gefärbt, aus der Farblösung direct auf den Object- träger gebracht, durch Aufpressen von Fliesspapier abgetrocknet und dann lufttrocken werden lassen, event. unter leichter Erwärmung. Dann sprangen die Schnitte leicht vom Glase ab oder Hessen sich leicht ab- ziehen. Der trockene Schnitt wurde dann in absoluten Alcohol versenkt. Ganz, ganz allmählich kam hier eine Extraction des Farbstoffes zu Stande, die dann mit wachsendem Wassergehalt des Alcohols, wie oben, allmählich zunahm. Kein alcoholische Lösungen der basischen Anilin- farbstoffe sind also vollständig unfähig, Bakterien sowohl wie thierisches Gewebe zu färben, und anderer- seits ist der absolute Alcohol unfähig, den Farbstoff aus gefärbten Bakterienzellen und aus gefärbten Zel- len thierischen Gewebes zu extrahiren. Wenn trotzdem gerade der absolute Alcohol als „Ent- färbungsmittel" zum „Differenziren" von gefärbten Schnitten empfohlen wird (speciell durch Weigert),^) so ist diese Wirkung des Alcohols darauf zurückzuführen, dass er hier auf Gewebe einwirkt, welche mit wässeriger Flüssigkeit (Farblösung) durchtränkt sind, dass der Alcohol hier also thatsächlich nicht als absoluter, sondern als mit Wasser verdünnter Alcohol zur Wirkung kommt. Der mit Wasser in gewissem Grade verdünnte Alcohol ist aber ein aus- gezeichnetes Mittel, die Anilinfarbstoffe aus den Zellen zu extrahiren. Es kommen hier zwei Eigenschaften desselben zur Geltung: erstens der Wassergehalt, welcher die Flüssigkeit befähigt, die Bakterien oder thierischen Zellen etc. zum Aufquellen zu bringen, und zweitens der Thatsaohe demonstriren will, so ist es noth wendig , das der Geisseifärbung (cf. oben p. 80 ff.) unterworfene Deckglaspräparat in trockenem Zustande zunächst in absoluten Alcohol, aus demselben dann in Xylol zu bringen und dann in Balsam einzuschhessen. ^) Virch. Arch. Bd. 84. ISSl. p. 275 ff. \ 100 -Ä.. Allgemeines. Alcoholgehalt, welcher die Flüssigkeit so viel geeigneter zur Lösung der Farbstoffe macht, als es das Wasser selbst ist. Und was für den Alcohol als Entfärbungsmittel gilt, das gilt auch für den Alcohol als Constituens von Farblösungen. Einen wässerig durchtränkten Schnitt können wir auch in einer rein alcoho- lischen Farblösung färben, aber nicht weil die letztere an und für sich färbende Eigenschaften hätte, sondern weil sich bei dem Zutritt der- selben zu dem Schnitte eine verdünnte alcohoKsche Farblösung bildet, die die Färbung bewirkt. Ebenso können wir ein trockenes Trocken- präparat mit rein alcoholischer Farblösung färben, wenn wir zum Abspülen der Farblösung nicht Alcohol, sondern Wasser nehmen. Die im Momente des Abspülens sich bildende verdünnte alcoholische Lösung be\\ärkt die Färbung. Hinsichtlich der hier aufgestellten principiellen Eigenschaften des absoluten Alcohols ist zu bemerken, dass einerseits bereits Weigert') darauf aufmerksam gemacht hat, dass man die Schnitte „über eine Stimde (bei intensiver Färbung noch länger) in Alcohol lassen kann, ohne dass sie die Kern- und Bakterienfärbung abgeben", und dass andererseits Friedländer-) betont hat, dass „ein grösserer Zusatz von Alcohol als etwa 10 ^/^ zu der Farblösung das Färbungsvennögen derselben beeinträchtigt". Dass aber der Alcohol als solcher gar keine entfärbenden und rein alcoholische Farblösungen gar keine färbenden Eigenschaften haben, ist, so viel ich weiss, zuerst von mir ausgesprochen worden. Wir werden derartige Eigen- schaften des Alcohols und alcoholischer Lösungen nur durchaus ver- ständlich finden müssen. Die Bakterienzelle ebenso wie die thierische Gewebszelle ist nur in Wasser quellbar, nie in absolutem Alcohol. Damit die Zelle aber aus irgend welcher mit ihr in Berührung kom- menden Flüssigkeit Bestandtheile in sich aufzunehmen vermag, muss sie in der Flüssigkeit zunächst in gewissem Grade aufzuquellen vermögen. Wir sehen hier sehr enge Analogien zwischen den Vorgängen, die sich bei der Färbung einer Zelle abspielen, und denjenigen, die bei der Einwirkung antiseptischer Flüssigkeiten auf die Zelle in Frage kommen.'^) Wie wir bereits oben (p. 31) mittheilten, fand E. Koch,*) dass eine alcohohsche Lösung von Carbolsäure nicht die geringste Einwirkung auf die Keimfähigkeit von Milzbrandsporen hat. ') Vircb. Arch. Bd. 84. 1881. p. 280. ■-) Mikroskopische Technik. 3. Aufl. Berlin 1886. p. 47. ^) Auch noch in anderer Hinsicht bestehen Analogien zwischen diesen beiden Arten von Vorgängen (cf. p. 78, Anra. 5). ') Mitth. a. d. Kais. Ges.-Amte. Bd. 1. 1881. p. 251. IV. Allgemeine Methodik der Bakterienbeobaclitung. 101 während wässerigen Lösungen derartige Einwirkungen sehr wohl zu- kommen. Nach Erledigung dieser principiell wichtigen Angelegenheit wollen wir uns mit den verschiedenen Punkten beschäftigen, Avelche von allgemeiner Bedeutung bei der Bakterienfärbung sind. Es sind dies drei Punkte: 1) die Qualität der Earblösung, 2) die Temperatur, bei der die Färbung vorgenommen Anrd, 3) die Zeitdauer der Einwirkung der Earblösung. Bezüglich des 2. resp. 3. Punktes gilt es ganz allgemein, dass die Färbung um so schneller vor sich geht, je höher die Temperatur ist, und dass sie desto intensiver wird, je länger wir die Farblösung auf das Object einwirken lassen. Bezüglich des 1. Punktes haben wir bereits erörtert, dass sich rein alcoholische Lösungen gar nicht zur Färbung eignen, dass sich aber Gemische aus emeni Theile derartiger Lösungen und etwa 10 Theilen Wasser (cf, p. 66) ausgezeichnet zur Färbung eignen. Wir haben ferner gesehen, dass die Loeffler'sche Methylenblaulösung (cf. p. 90), welche ebenfalls eine wässerig- alco- holische ist, aber einen ganz geringen Zusatz von kaustischem Kali enthält, sich ganz besonders gut zu Färbungen eignet. — Es hat sich nun gezeigt, dass das Färbungsvermögen der wässerig- alco- hülischen Lösungen überhaupt durch bestimmte Zusätze sehr erheblich gesteigert werden kann. Mehrere solcher intensiv färbenden Tinctionsflüssigkeiten sind seit Jahren in Gebrauch und haben sich sehr bewährt. Dahin gehört an erster Stelle die Ehrlich"sche Lösung, welche mit Fuchsin oder mit den Violetten hergestellt werden kann, imd die ursprünglich zur Färbung der Tuberkelbacillen construirt wurde, ferner die Ziehl'sche Lösung, Avelche mit Fuchsin hergestellt wii"d. Die Ehrlich'sche Lösung') ist eine Mischung einer gesättigten wässerigen Anilinlösung mit gesättigter alcoholischer Farbstofflösung. Sie wird folgendermassen dargestellt: 4 ccm Anilin (Anilinöl) werden mit 100 ccm Wasser geschüttelt. Hierbei wird die grösste Menge des Anilins gelöst. Man filtrirt nun durch ein mit Wasser vollständig angefeuchtetes Filter (angefeuchtet deshalb, damit die ungelösten öligen Anilintröpfchen auf dem Filter zurückgehalten werden) und setzt dann zu dem klaren Filtrate („Anilinwasser") ^) cf. Deutsche med. Wochenschr. 1SS2. p. 270. 102 A. Allgeraeines. 11 ccm gesättigte alcoholisclie Fuchsin- (oder Gentianaviolett- oder Methylviolett-) Lösung. Die Mischung -nird geschüttelt. Diese Ehrlich'schen Lösungen setzen in den ersten Stunden nach ihrer Bereitung Farhstolfiiiederschläge ab. Schnitte, die unmittelbar nach der Herstellung der Flüssigkeit mit der- selben behandelt werden, zeigen, gleichgültig ob man die Farbmischung filtrirt oder imiiltrii-t zur Anwendung gebracht hat, ihre Oberfläche mit kleinsten Farbstofihiederschlägen bedeckt, die zu entfernen (ohne die Färbimg im Uebrigen zu schädigen) es kein Mittel giebt. Nach 24 Stunden jedoch hat die Lösung sich geklärt, und nun stellt sie ein sehr gutes, allgemein anwendbares Färbungsmittel dar. Die Ehr- lich 'sehen Lösungen werden mit Vortheil, wie bereits bemerkt, zur Färbung von T u b e r k e 1 b a c i 1 1 e n angewendet. Handelt es sich hier- bei um Deck g last rockenpräpa rate (die von S p u t u m her- gestellt sind), so bringt es die Nachbehandlung dieser Präparate mit sich, dass für diesen Zweck die Ehrlich'schen Lösungen auch ganz frisch, eben dargestellt, gebraucht werden können; zur Dar- stellung von Tuberkelbacillen in Schnitten aber muss man 24 Stun- den alte Lösungen vei"wenden. Die Ehrl ich 'sehen Lösungen halten sich eine Reihe von Tagen bis Wochen brauchbar. Allmählich jedoch wird eine derartige Lösung missfarbig, hell; der Farbstoff setzt sich als schmieriger Belag auf dem Boden und an der Wand des Gefässes ab, und die Flüssigkeit muss dann verworfen und durch neue ersetzt werden. Die Ziehl'sche Lösung') ist eine Mischung von 5procentiger wässeriger Carbolsäurelösung mit alcoholischer Fuchsinlösung. Man stellt sie dar durch inniges Verreiben von 1 g Fuchsin mit 100 ccm 5proc. wässeriger Carbolsäurelösung unter alimäh- lichem Zusätze von 10 ccm Alcohol. Die ZiehTsche Carbolsäure-Fuchsinlösung hat ebenfalls ein ausserordentliches Tinctionsvermögen , kommt aber darin den Ehr- lich'schen Lösungen sicher nicht gleich. Die ZiehTsche Lösung ist dauernd haltbar. In diesem Punkte, durch den sich die Ziehl'sche Lösung von den Ehrlich'schen Lösungen wesentlich unterscheidet, liegt übrigens gerade ein Grund des geringeren Färbungs- vermögens der Ziehl "sehen Lösung gegenüber den Ehrlich"schen. TJnna"^) hat nämlich auf das allgemein gültige Gesetz aufmerksam ^) cf. Deutsche med. Wochenschr. 1SS2. p. 4.51. 2) Centralbl. f. Bakt. Bd. 3. 1SS8. p. 254. lY. Allgemeine Methodik der Bakterienl)eobachtung. 103 gemacht, dass diejenigeu Farblösungeu am intensivsten färl)en, in denen der Farbstoff am schlechtesten gelöst ist, ohne jedoch ausgefällt zu werden. Unna hat diesen Zustand einer Farblösung mit dem Aus- druck der „Schwebefällung" belegt. Bei den Ehr lieh 'sehen Lösungen ist dieser Zustand der Schwebefällung vorhanden, bei der Ziehl'schen Lösung nicht. Ich würde deshalb überall da, wo es darauf ankommt, eine möglichst intensive Färbung zu erreichen, die Ehrlich'schen Lösungen verwenden und eventuell die Mühe nicht scheuen, mir dieselben fiisch darzustellen; nur im Nothfalle würde ich als Ersatz zu der ZiehTschen Lösung greifen, die immer vorräthig und jederzeit gebrauchsfertig im Laboratorium gehalten werden kann.^) Einen noch höheren Grad des Färbungsvermögens hat Loeffler^) den Ehrlich'schen Lösungen dadurch verliehen, dass er den Alcohol bei ihrer Zusammensetzung ganz wegliess und etwas Natronlauge zu- fügte. Loeffler setzte sich zur Färbung der Geissein an Bakterien, die zunächst mit einer Beize behandelt waren, die Farlilösung ursprüng- lich folgendermassen zusammen (cf. oben p. 83) : Zu 100 ccm gesättigtem Anilinwasser ^) wird 1 ccm 1 procentige Natriumhydratlösung zugefügt. Das Gemisch wird mit 4 — 5 g festem Fuchsin (oder Methylviolett oder Methylen- blau) tüchtig geschüttelt. Diese Farbflüssigkeit dürfte an Litensität des Färbungsvennögens von keiner der bekannten Farblösungen übertroffen werden. Man sieht ohne Weiteres, dass hier ein noch höherer Grad der Unna'schen „Schwebefällung" bestehen muss als bei den Ehrlich'schen Lösungen, ^) Manche Praktiker gebrauchen die (unveränderte oder mit Wasser verdünnte) Ziehl'sche Lösung mit Vorliebe und regelmässig, und zwar nicht nur in solchen Fällen, in denen die Anwendung einer besonders stark färbenden Flüssigkeit indicirt ist, sondern auch dort, wo eine wässerig-alcoholische Lösung vollständig ausreichen würde. Der Grund für diese allgemeine BeUebtheit der ZiehLschen Lösung ist ihre Haltbarkeit. Der Verf. möchte diese Lösung für die geschilderten Zwecke durchaus nicht empfehlen, da sie die sehr wenig angenehme Eigenschaft besitzt, die Präparate mit grösseren oder kleineren rundlichen Inseln von Farbstoff zu bedecken, die sich durch Abspülen mit Wasser nicht entfernen lassen: die Präparate werden mehr oder weniger unsauber. (Diese letztere Thatsache wird von vielen Praktikern allerdings ruhig hmgenommen.) Die Farbstoffinseln stammen nicht (wie es z. B. bei den Farbstoffausscheidungen älterer wässerig-alcoholischer Fuchsinlösungen [cf. p. 66] der FaU ist) aus dem Innern der Flüssigkeit, sondern von ihrer Oberfläche, auf der — während die Flüssigkeit selbst dauernd klar bleibt — sich kleinste ölige Färb Stofftröpfchen schwimmend vorfinden. -) Centralbl. f. Bakt. Bd. 6. 1889. p. 213. ■^) Dargestellt wie bei der Bereitung der Ehrlich'schen Lösungen. 104 A. Allgemeines. da ja der Zusatz des Alcohols, des ausgezeichnetsten Lösungsmittels unserer Farbstoffe, fehlt. Unerwähnt will ich übrigens nicht lassen, dass H. Kühne i) als Univer salbakterienf ärbungsmittel eine C a r b o 1 m e t h y 1 e n b 1 a u 1 ö s u n g (dargestellt aus 1,5 g Methjdenblau , 10 ccni Alcohol und 100 ccm 5 procentigem Carbolwasser) angegeben und empfohlen hat. In dem quantitativ verschiedenen Färbungsvermögen der citirten Farblösungen einerseits, andererseits in der verschiedenen Zeitdauer der Einwirkung dieser Lösungen auf das Object und in der verschieden hohen Temperatur, bei der dies geschieht, haben wir die Momente, welche für die Intensität der zunächst resultirenden Färbung von Be- deutung sind. Es hat sich nun die wichtige Thatsache herausgestellt, dass sich nicht alle Bakterienobjecte einer und derselben Farblösung gegenüber gleichartig, der Färbung gleichmässig zugängig, verhalten. Verfeinerte Methoden werden ohne Zweifel in dieser Beziehung vielfache Differenzen zwischen den verschiedenartigen Objecten auffinden, die uns heute noch unbekannt sind. Wie die Dinge heute stehen, kann man im Allgemeinen nur unterscheiden zwischen solchen Objecten, die den Farbstoff leicht aufiiehmen, und solchen, die ihn schwer aufnehmen; oder anders ausgedrückt : wir haben zu unterscheiden zwischen leicht färb baren Objecten und schwer färbbaren Objecten. „Leicht färbbar" wollen wir solche Objecto nennen, die, mit wässerig-alco- holischen Farbstofflösungen bei gewöhnlicher Temperatur behandelt, im Trockenpräparat die Färbung innerhalb weniger Secunden, im Schnitte innerhalb weniger Minuten annehmen, „schwer färbbar" solche, die unter denselben Bedingungen die Färbung noch nicht an- nehmen, zu deren Färbung es intensiver wöi'kender Methoden bedarf. Ganz allgemein gilt es ferner, dass diejenigen Objecto, die den Farbstoff leicht annehmen, denselben auch leicht wieder abgeben, dass andererseits diejenigen, die ihn nur bei intensiverer Behandlung mit der Farblösung aufnehmen, ihn auch energischer festhalten, weniger leicht abgeben. Wir können das auch so ausdrücken: Die leicht färbbaren Objecto sind auch leicht entfärbbar, die schwer färbbaren auch schwer entfärbbar. Oben haben wir definirt, was wir imter „leicht färbbar", „schwer färbbar" verstehen. Was verstehen wir aber unter „leicht entfärbbar", „schwer entfärbbar"? Um diese Fragen zu beantworten, müssen wir uns über die Mittel, ') Praktische Anleitung zum mikroskopischen Ncachweis der Bakterien im thierischen Gewebe. Leipzig. 1S8S. IV. Allgemeine Methodik der Bakterienbeobacbtung. 105 die uns zur Entfärbung der gefärbten Zelle zu Gebote stehen, informiren. Absoluter Alcohol extrahirt, wie auseinandergesetzt, den Farbstoff aus der gefärbten, trockenen Zelle nicht. Wird der Alcohol aber mit Wasser verdünnt, so tritt eine Extraction des Farbstoffes ein. Dieselbe erfolgt aber nicht momentan, sondern langsam und allmählich. Wir können gefärbte Schnitt- sowohl wie Trockenpräparate ihres Farbstoff- gehaltes allmählich vollständig berauben, wenn wir sie in verdünnten Alcohol legen und darin liegen lassen. Die Gründe für die in dieser Beziehmig verschiedene Wirkung des absoluten und des verdünnten Alcohols haben wir oben (p. 99) auseinandergesetzt. Der mit Wasser verdünnte Alcohol ist also ein Extractionsmittel für den Farbstoff, ein Entfärbungsmittel. Sehr energisch wirkt im Vergleich zu dem verdünnten Alcohol der öfters wiederholte Wechsel zwischen absolutem Alcohol und Wasser. Man wird wohl nicht fehl- gehen, wenn man die intensiven Diffusionsströme, die hier in und an dem Objecte auftreten müssen, für die Extractionswirkung wesenthch mit verantwortlich macht. Die stärksten Entfärbungsmittel aber bilden die S ä u r e n. Schon eine ganz verdünnte Essigsäure hat intensiv entfärbende Eigen- schaften. Verdünnte Salz-, Salpeter-, Schwefelsäure oder mit Säure versetzter Alcohol wirken noch stärker. Ganz be- sonders stark entfärbende, durch nichts zu übertreffende Einwirkungen erzielt man, wenn man abwechselnd wässerige Säurelösungen und Alcohol auf die gefärbten Objecte einwirken lässt, oder wenn man angesäuerten Alcohol mit Wasser abwechseln lässt. Die bei dem jedesmaligen Wechsel auftretenden Difftisionsströme (cf. auch den vorigen Absatz) sind es ohne Zweifel, welche hier die starke Entfärbungswirkung zu Wege bringen.') ^) Sehr schön lässt sich die ausserordentlich kräftig entfärbende Wirkung des Wechsels zwischen Wasser und Alcohol in Gegenwart von Säure durch folgenden Versuch, den ich seit Jahren in meinen Cursen vor- führe, demonstriren : Mit Hülfe irgend einer Fuchsin- oder Violettlösung macht man sich an der Volarseite eines Fingers einen Farbfleck. Man versucht vergebens diesen Fleck durch Bespülen mit Wasser zu entfernen; nach dem sorgfältigen Abtrocknen des Wassers versucht man ebenso vergeblich Alcohol, dann einen Alcohol, welchem i^jo Salzsäure zugesetzt sind, zu diesem Zwecke. Der Fleck ist nach wie vor un- verändert vorhanden. Träufelt man nun aber (ohne dass irgendwie an dem Finger gerieben wird) einige Tropfen des genannten Salzsäure-Alcohols auf den Fleck, spült dann mit Wasser ab, träufelt wiederum Salzsäure - Alcohol auf, spült wieder mit Wasser ab und wiederholt diesen AVechsel in derselben Weise eine Anzahl von Malen hinter einander, so sieht man, wie der Fleck nun in kürzester Frist spurlos ver- schwindet. lOQ A. Allgemeines. Für unseren Arbeitstisch möchte ich als stets voiTäthig zu haltende Entfärbimgsmittel empfehlen : 1) öprocentige wässerige Essigsäurelösung. Dieselbe kann ohne Weiteres verwendet, aber auch mit mehr oder weniger Wasser verdünnt zur Anwendung gebracht werden. 2) 20 pro centige wässerige Salpetersäurelösung. 3) 3procentigen Salzsäure-Alcohol (100 Alcohol abso- lutus, 3 Salzsäure). Von manchen Seiten Avird auch Salpetersäure -Alcohol empfohlen. Ich möchte dieser Empfehlung weniger das Wort reden; denn die Salpetersäure bewirkt sehr leicht Oxydationen des Alcohols, und man hat dann im gegebenen Ealle häufig ein undefinirbares Gemisch ver- schiedener Aether etc. an Stelle der Alcohol -Salpetersäuremischung. Der Salzsäure-Alcohol jedoch ist unverändert haltbar. Unter „leicht entfärbbaren" Objecten verstehe ich nun solche, welche die Färbung bei der Behandlung mit 20procentigem Salpetersäurewasser oder mit 3procentigem Salzsäure-Alcohol in kür- zester Zeit (Secunden bis Minuten) verlieren; unter „schwer ent- färbbaren" solche Objecte, die die Färbung unter diesen Bedingungen behalten. Man kann folgende Sätze aufstellen: 1) Leicht färbbar und leicht entfärbbar sind (es färben sich in wässerig-alcoholischen Farbstofflösungen bei gewöhnlicher Temperatur in kürzester Zeit, und es entfärben sich in 20proc. Salpetersäurewasser und ebenso in 3proc. Salzsäure-Alcohol in kürzester Zeit) : a) Bakterien (excl. Tuberkel- [und Lepra-] Bacillen und excl. Bacillensporen). b) Zellkerne. 2) Schwer färbbar und schwer entfärbbar sind (es färben sich nur bei Anwendung intensiver wirkender Methoden, und es entfärben sich, einmal gefärbt, nicht bei kurzer Einwirkung von 20proc. Salpetersäurewasser oder 3proc. Salzsäure-Alcohol): Tuberkel- (und Lepra-) Bacillen und Bacillensporen. Worin die intensiver wirkenden Methoden bestehen, er- giebt sich von selbst, wenn wir die oben (p. 101) dargelegten Momente in Ei-wägung ziehen, welche für die Litensität der Färbung in Betracht konunen. Um intensiv färbend einzuwirken, werden wir uns zu- nächst solcher F a r b 1 ö s u n g e n bedienen müssen, denen besonders grosse Tinctionskraft zukommt, d. h. also der Ehrlich'schen Lösungen, event. auch der Zieh!' sehen Lösung; hiermit werden wir IV. Allgemeine ^Methodik der Bakterienbeobachtung. 107 in den meisten Fällen das Ziel erreiclien. Kommt es auf ganz be- sonders intensive Einwirkung an, so werden wir uns die von Loeffler (cf. p. 103) angegebenen alkalischen Anilinwasserfarblösungen, die alco- holfrei sind, darstellen müssen. Diese intensiv wirkenden Lösungen werden wir dann, und das ist das zweite Moment, nicht bei gewöhn- licher Temperatur, sondern bei höherer Temperatur auf das Object einwirken lassen, und wir werden (dritter Punkt) nicht kurze, sondern längere Zeit die Einwirkung andauern lassen. Berücksichtigen wir im gegebenen Falle alle drei Punkte, die Qualität der Farblösung, die Temperatur und die Zeit, so wird die Intensität der Färbung ihr Maximum erreichen. Gewöhnlich aber genügt es, die intensiv färbende Flüssigkeit bei höherer Temperatur kürzere Zeit oder bei gewöhnlicher Temperatur längere Zeit einwirken zu lassen. Das erstere wird sich besonders für Ti'ockenpräparate, das letztere besonders für Schnitte empfehlen. Deckglastrockenpräparate können wir, ohne dieselben zu schädigen, mit kochender Farbstofflösung behandeln, so lange wir Avollen. Schnitte vertragen, wie oben (p. 95) gesagt, höchstens Temperaturen bis etwa 40—50 o C. Die schwer färbbaren Bakterienobjecte, die Tuberkel- (und Lepra-) Bacillen und die Bacillensporen, verhalten sich nun hinsichtlich der Zugängiichkeit für den Farbstoff verschieden. Die Leprabacillen setzen dem Eindringen des Farbstoffes den geringsten Widerstand ent- gegen. Sie können sich sogar manchmal, wenigstens in einzelnen Exemplaren, wie leicht färbbare Bakterien verhalten, und es ist diese Eigenschaft von B a u m g a r t e n ^) zu einer mikroskopischen Differential- diagnose zwischen Lepra- und Tuberkelbacillen vei'wandt worden. Die Tuberkelbacillen verhalten sich erheblich resistenter gegen das Ein- dringen des Farbstoffes. Am resistentesten verhalten sich die Bacillen- sporen. Die letzteren bedürfen also zum Zustandekommen der Färbung der relativ intensivsten Behandlung. Sind die genannten Objecte ein- mal gefärbt, haben sie den Farbstoff einmal aufgenommen, so geben sie denselben an die Entfärbungsmittel, wie erwähnt, nicht leicht wieder ab, während andere Theile des Präparates, denen die Eigenschaft der leichten Färbbarkeit zukommt, sich bei derartiger Behandlung mit Entfärbungsmitteln wieder entfärben. Es resultirt dann naturgemäss eine isolirte Färbung der vorhandenen schwer färbbaren Objecte; und damit ist dann auch die Möglichkeit gegeben, die wieder ent- färbten, leicht färbbaren Theile secundär mit einer gegen die Färbung der schwer färbbaren 01)jecte contrastirenden Färbung, mit einer ^) Zeitschr. f. wissensch. Mikroskopie. Bd. 1. 1884. 108 A. Allgemeines. Contrast- (Gregen- oder Grund-) Färbung, zu versehen. Man kann so Präparate mit Doppelfärbung herstellen. Bei primärer Fuchsinfärbung wählt man als Gegenfarbe Meth^'lenblau , bei primärer Violettfärbung als Gegenfarbe Bismarckbraun oder Carniin. Wir können auf diese Weise z. B. in einem Tuberkelbacillenschnitt- präparate die Tuberkelbacillen fuchsinroth, die Kerne des Gewebes meth3denblau färben; wir können ims Ti-ockenpräparate von tuberculösem Sputum herstellen, in welchen die Tuberkelbacillen violett, die übrigen vorhandenen Bakterien und die Kerne der Eiterzellen etc. bismarckbraun gefärbt sind ; wir können sporenhaltige JMilzbrandfäden so färben , dass die Sporen fuchsinroth, das Bacillenprotoplasma methjlenblau erscheinen. Auf die Sporenfärbung werden wir bei Gelegenheit der Be- trachtung des Mlzbrandbacillus , auf die Tuberkelbacillenfärbung bei Geleo'enheit des Tuberkelbacillus des Näheren eino-ehen. 6. Die Gram'sche Methode der Kernentfärbung. Wie wir gesehen haben, lassen sich Bakterien, welche in Schnitten thierischen Gewebes enthalten sind, durch die Färbung mit basischen Anilinfarbstoffen sehr leicht der Beobachtung zugänglich machen. Wir brauchen einen solchen Schnitt nur in eine der angegebenen Farb- lösungen zu legen und hinterher abzuwaschen und mit schwachen Ent- färbungsmitteln zu behandeln, um die Bakterien gefärbt zu Gesicht zu bekommen. Freilich sind die Kerne des Gewebes stets mitgefärbt. Würden wir auf den gefärbten Schnitt stärkere Entfärbungsmittel ein- wirken lassen, z. B. 3proc. Salzsäure- Alcohol , oder würden wir die schwächeren Entfärbungsmittel längere Zeit einwirken lassen, so würden allerdings die Kerne ihre Färbung verlieren; zu gleicher Zeit aber wüi'den auch die Bakterien ihre Färbung abgeben und verblassen. Wollen wir also in einem Schnitte die Bakterien gefärbt haben, so müssen wir eine Kern färb ung mit in den Kauf nehmen; es sei denn, dass es sich um die schwer färb- und entfärl)])aren Tuberkel- (oder Lepra-) Bacillen handelte; die specifischen Eigenthümlichkeiten dieser Bakterien bringen es mit sich, dass wn- sie in isolirter Färbung darstellen können. Aus dem Schema der bisher betrachteten Färbungsmethoden fällt nun vollständig heraus ein eigenthümliches Verfahren der färberischen Behandlung bakteriologischer Präparate, welches der dänische Forscher Christian Gram^) im Jahre 1884 zu Berlin entdeckte. Gram Fortscbr. d. Med. 1SS4. No. IV. Allgemeine Methodik der Bakterienbeobacbtuny. 109 gelangte durch Zufall zu dieser Entdeckung. Er hatte nämlich, wie er angiebt, versucht, in pathologisch veränderten Merenschnitten eine Doppelfärbung dadurch herzustellen, dass er dieselben zunächst in Ehrlich 'scher Anilinwassergeutianaviolettlösung und darauf in Jod- jodlvaliumlüsung behandelte. Die Kerne sollten violett, die Harncjdinder braun gefärbt werden. Als er nun die so behandelten Schnitte in Alcohol behufs der Differenzirung und Entwässerung brachte, beob- achtete er, dass die Schnitte sich vollständig und schnell entfärbten, d. h. dass die sonst in Alcohol verbleibende Kernfärbung verschwand. In dem Schnitte vorhandene Bakterien hatten sich aber hierbei nicht mit entfärbt; im Gegentheil: sie zeigten sich äusserst intensiv, dunkel tingirt. Gram hatte also ein Verfahren gefunden, die Gewebskerne zu entfärben, ohne die Bakterienfärbung anzutasten. TDas Gram' sehe Verfahren ist also kein eigentliches Färbungs- veriahren, sondern es ist ein Entfärbungs verfahren, und zwar ein Kernentfärbungs verfahren.^ Hiermit war viel gewonnen. Es war die Möglichkeit eröffnet, jede beliebige Bakterienart in isolirter Färbung im Schnitte darzustellen und nach Belieben auch eine Gegen- färbung der Kerne eintreten zu lassen. Gram fand aber sofort, dass nicht alle Bakterienarten bei der geschilderten Entfärbungsmethode ihre Fär- bung behalten, sondern dass es Bakterienarten giebt, welche sich bei der geschilderten Behandlung ebenso wie die Kerne des Gewebes entfärben. Die ursprüngliche Gram' sehe Vorschrift war nun die, dass die Schnitte aus Alcohol in die E h r 1 i c h ' sehe Anilinwassergentianaviolett- lösung für mehrere Minuten gelangen. Hierauf werden sie in eine Jodjodkaliumlüsung (l Jod, 2 Jodkalium, 300 Wasser) für mehrere Minuten, darauf in Alcohol gebracht. Während sich der Schnitt in der Jodlösung glänzend schwarz gefärbt hat, giebt er in dem Alcohol sofort eine purpurrothe Farbstoffwolke ab. Wird kein Farbstoff mehr ausgezogen, so kommt der Schnitt in Nelkenöl; hier verliert er eventuell noch etwas Farbstoff. Darauf wird er in Balsam eingeschlossen. Befolgt man diese ursprüngliche G r a m ' sehe Vorschrift genau, so wird man meist gute Resultate erzielen; mitunter aber führt diese Behandlung nicht zu einer genügenden Entfärbung der Kerne. Es gelingt jedoch durch bestimmte kleine Abänderungen das Verfahren so zu gestalten, dass es unter allen Umständen zu dem gewimschten Ziele führt. Im Jahre 1886 habe ich'-) zuerst eine Modilication des Gram'- 1) Fortschr. d. Med. 1884. No. (5. p. 186. -) In der mikroskopischen Technik von C. Friedländer, 3. Aufl. p. 50 — 51 (nach brieflicher Mittheilung an Fr.) angegeben. 110 A. Allgemeines. sehen Verfahrens angegel3en, die ich dann im folgenden Jahre aus- führlich publicirt habe. ^) Diese Modification, welche unter der Be- zeichnung des „Gram-Günther' sehen" Verfahrens bekannt geworden und der ursprünglichen Methode gegenüber vielfach mit Vortheil an- gewendet worden ist, unterscheidet sich dadurch von dem ursprimg- lichen Verfahren, dass nicht nur Alcohol, sondern daneben auch 3proc. Salzsäure- Alcohol zur Extraction des Farbstoffes benutzt wii-d; wesenthch ist aber, dass der Säurealcohol nur ganz vorübergehend zur Anwendung gelangt. Eine zweite Abweichung von der ursprünglichen Gram' sehen Vorschrift liegt darin, dass nicht Nelkenöl (welches bei Gram eventuell noch zur Extraction des Farb- stoffes diente), sondern Xylol zur Verwendung gelaugt. Das Gram-Günther' sehe Verfahren gestaltet sich mm im Speciellen folgendermassen : 1) Der Schnitt gelangt aus Alcohol in (eben filtrirte) Ehrlich' sehe Amlinwassergentiana\iolett- (oder MethyMolett-) Lösung auf 1 — 2 Mi- nuten. -) (Die Farblösung muss mindestens 24 Stimden alt sein [cf. p. 102]. Sie darf aber nicht zu alt sein. Ist sie bereits eine gi'össere Reihe von Tagen alt, so hat sie zuviel von ihrem Farbstoff bereits abgegeben; die Färbimg wird dann wenig intensiv, die Resultate werden ungenügend. Aus diesem Grunde muss auch streng darauf gesehen werden, dass zur Bereitung der Lösung [cf. p. 101] wirklich gesättigte alcoholische Farbstoff lösung verwandt wird.) 2) Herausnehmen des Schnittes mit der Nadel, Abtupfen der über- schüssigen Farblösung auf Fliesspapier und Einbringen des Schnittes in Jodjodkaliumlösung (1 Jod, 2 Jodkalimn, 300 Wasser) auf 2 Mnuten. (Der Schnitt liegt dabei, gut ausgebreitet, auf dem Grunde des Schälchens.) 3) In Alcohol auf V-. ^linute. 4) In 3proc. Salzsäure-Alcohol auf genau 10 Secunden. 5) ]\Iit Ablauf der 10 Secunden sofortige Uebertragung in neuen, bereits vorher bereit gestellten reinen Alcohol auf mehrere Minuten. 6) Noch ein oder mehrere Male (in nicht zu langen Pausen) TJebertragung in frischen Alcohol bis zu maximaler Entfärbung (es darf sich schliesslich keine Farbstoffwolke mehr von dem Schnitte abheben). 7) In Xylol. Hier kann der Schnitt beliebig lange liegen. Er ') Deutsche med. Wochenschr. 1887. No. 22. p. 474. ^) Eine Ausnahme machen Tuberculose- und Lepraschnitte. Die letz- teren werden V2 Stunde, die ersteren 12—24 Stunden gefärbt. IV. Allgemeine Methodik der Bakterienbeobachtimg. Hl hält sich in dem Xylol unbegTeuzt lauge unverändert. Jedoch kann er, mit Xylol durchtränkt, sofort, d. h. spätestens ^/^ Minute nach dem Einlegen in Xylol, übertragen werden 8) mit dem Spatel auf den Objectträger. 9) Xach Abtupfen des Xylolüberschusses wird ein Tropfen Xylol- Balsam aufgebracht und auf diesen das Deckglas gelegt. Will man eine Gegenfärbung der Kerne erzielen, so kann man, wie das Gram that, die in Alcohol entfärbten Schnitte auf einen Augenblick in w ä s s e r i g e B i s m a r c k b r a u n 1 ö s u n g tauchen, dann wieder in Alcohol entwässern und nach der Passage durch Xylol in Balsam einschliessen. Mitunter bekommt man so ganz gute Eesultate. Häufig aber verlieren die Bakterien bei dieser Manipulation etwas von der Präcision ihrer Färbung, und bei Erysipel- Schnitten werden die Coccen, wie ich gefunden habe, bei dieser Gelegenheit sogar voll- ständig entfärbt. Es empfiehlt sich also die nachträgliche Grund- färbung mit Bismarckbraun im Allgemeinen durchaus nicht. Ein anderes Verfahren der Grundfärbung bei der Gram' sehen Schnittbehandlung ist jedoch für alle Fälle durchaus zu empfehlen. Bei diesem Verfahren wird die Kernfärbung vor der Bakterienfärbung vorgenommen. Die ungefärbten Schnitte gelangen hier aus dem Alcohol 1) in Wasser auf mehrere Minuten, darauf 2) in soeben filtrirte Picrocarminlösung ^) 2 — 5 JVIinuten. 3) Sie werden darauf in vier- bis fünfmal erneuertem Wasser aus- gewaschen und dann 4) in Alcohol gebracht. Die Schnitte haben nun eüie wundervolle Kemfärbung (Carmin) an- genommen. In dem Alcohol hönnen sie behebig lange, ohne sich zu verändern, aufbewahrt werden. Man kann sie dann zu beliebiger Zeit ^) Die Lösung stellt man sich nach Friedländer (Mikroskopische Technik. 3. Aufl. 1SS6. p. 35) so dar, dass man eine Lösung von Carmin in Ammoniak (1 Carmin, 1 Ammoniak, 50 Wasser) zurecht macht und zu dieser soviel gesättigte \vässerige Picrinsäurelösung zusetzt, bis der entstehende Niederschlag (Carmin) beim Umrlüu'en nicht mehr gelöst wird. Eine Spur Ammoniakzusatz löst den Niederschlag wieder auf. Diese Vorschrift hat sich mir stets bewährt. — Filtration der Picro- carminlösung kura vor dem Gebrauche ist deshalb nothwendig, weil diese Lösimg,- wenigstens die im Handel käufliche, gewöhnlich lebende Mikroorganismen (ich fand namentlich HefezeUen häufig) enthält, die zunächst — durch die Filtration — ent- fernt werden müssen, wenn man nicht sehr störende Beimengungen im Präparate haben wiU. Zur Verhinderung des Wachsthums von IMikrooi'ganismen in der Picro- carminlösung giebt man der letzteren nach Friedländer's Empfehlung auf je 100 ccm einige Tropfen Phenol zu. 112 ^- Allgemeines. der Gram' sehen resp. G r a m - G ü n t h e r ' sehen Behandlung unter- werfen, die genau so ausgeführt wird, als wenn es sieh um vollständig ungefärbte Schnitte handelte. Die Carminfärbung der Kerne wird durch die G r a m ' sehe Behandlung in keiner Weise alterirt. Wie wir oben schon angaben, bleiben bei der Kementfärbung nach der Gram' sehen Methode eine Reihe von Bakterienarten gefärbt; eine andere Eeihe von Arten theilen das Schicksal der Kerne und entfärben sich. Man sagt von den ersteren auch: „Sie färben sich nach der Gram 'sehen Methode", von der anderen „sie färben sich nicht nach der Gram' sehen Methode". Man sagt auch einfach „sie färben sieh nach Gram" resp. „nicht nach Gram". Es ist aber zu betonen, dass eüie jede Bakterienart sich entweder auf die eine oder auf die andere Seite stellt. Eine Zwischenstufe in dem Verhalten giebt es nicht. Von den pathogenen Bakterienarten färben sieh nach Gram (d. h. bleiben gefärbt, während sieh die Kerne entfärben) : der ]VIilzbrandbacillus, der Tuberkelbaeillus, der Leprabacillus, der Diphtheriebaeillus, der Bacillus der Mäusesepticaemie und des Schweinerothlanfs, der Tetanusbacillus, die Streptococcen (Erysipel, Pyaemie, Phlegmone), der Staphylocoeeus pyogenes aureus. der Diplococcus pneumoniae A. Fraeukel, der Mcrocoeeus tetragenus. Ausserdem gehört in diese Gruppe der Actinomyees bovis s. hominis. Es färben sich nicht nach Gram (d. h. entfärben sieh zusammen mit den Kernen) : der Tj^phusbaeillus, der Rotzbaeillus, der Bacillus des malignen Oedems, der Rauschbrandbacillus, der Bacillus der Septicaemia haemorrhagica (Hühnercholera, Kaninchensepticaemie, Sehweineseuehe, Binder- und Wildseuchej, der Kommabaeillus der Cholera asiatica, der Bacillus pneumoniae Frie dl ander, der Gonorrhoecoecus, die Spirochaete des Recurrensfiebers. Haben wir oben angegeben, dass in Schnitten, die sich für die IV. Allgemeine Methodik der Bakterienbeobachtung. 113 Gram' sehe Beliaudlung eig-nen, die Kerne sich bei dieser Behandlung entfärben und allein die Bakterien gefärbt zurückbleiben, so müssen wir dieser Angabe jetzt eine gewisse Einschränkung auferlegen. Es giebt, von den Bakterien abgesehen, bestimmte Bestandtheile des Ge- webes, welche bei der Gram' sehen Entfärbung die einmal angenommene Färbung stets beibehalten. Dies sind: 1) die sogenannten Kerntheilungsfiguren, 2) die Mastzellenkörner (cf. p. 96), 3) die Hornschicht der Epidermis. Ferner halten auch die serösen Ueberzüge der Organe und die an- grenzenden Zonen der letzteren der Gram' sehen Behandlung gegen- über die Färbung ausserordentlich fest. Es ist hier zu bemerken, dass von pflanzlichen Objecten nicht etwa nur bestimmte Bakterienarten bei der Gram' sehen Entfärbung gefärbt bleiben, sondern auch andere Dinge, z. B. Hefezellen etc. Die Gram' sehe Methode ist übrigens nur auf ganz bestimmte Farbstoffe beschränkt. Mit Fuchsin, mit Methylenblau, mit Bismarek- braun wird man nie Eesultate bekommen. Einzig und allein anwend- bar sind die sogenannten Pararosaniline. Wir verdanken diese Kenntniss Unna, welcher die bei der Gram 'sehen Methode in Be- tracht kommenden Verhältnisse zum Gegenstande einer ausführliehen Studie!) gemacht hat. Den Pararosanilinen, zu denen Methyl- violett, Gentianaviolett und Victoriablau gehören, stehen die ßosaniline gegenüber. Beide Gruppen leiten sich ab von dem aus dem Methan CH^ abgeleiteten Triphenylmethan C(CeH.).3H, aus dem durch Einführung dreier Amidogruppen und einer Hydroxyl- gruppe das farblose Pararosanilin oder Triamidotriphenyl- karbinol C(CeH^ -NH^).. OH wird. Das salzsaure Salz des letzteren ist eins der färbenden Pararosaniline und hat die Zusammen- setzung C(Cy H^ • NH2)2 • C(jH^ • NH2 Gl. Die R s a n i 1 i n e unter- scheiden sieh dadurch von den Pararosanilinen, dass statt einer der drei Phenylgruppen eine ToluylgTuppe (statt CgHg also CgH^ • CH3) in das Methan eintritt. Wie gesagt, sind nur die Pararosanilin- verbindungen (Methylviolett, Gentianaviolett, Victoriablau) für die Behandlung nach Gram anwendbar. Der Grund hierfür ist nach Unna die starke Verwandtschaft, welche diese Farbstoffe zu dem Jod besitzen. Die genannten Farbstoffe muss man aber stets in Ge«talt der ^) Die Eosaniliae und Pararosaniline. Eine bakteriologische Farbenstudie. (Monatsh. f. prakt. Dermat. Ergänzungsheft 1. 1S87.) Günther, Bakteriologie. 4. Auflage. 8 114 A. Allgemeines. Ehrlich* sehen Lösung, d. h. in iV n i 1 i n w a s s e r gelöst, zur An- wendung bringen ; sonst hekonmit man weniger befriedigende Resultate. Man kann übrigens , wie ich gefunden habe , die G r a m ' sehe Methode resp. meine Modification dieser Methode auch mit der oben (p. 95) bereits erwähnten U n n a ' sehen A n t r o c k n u n g s m e t h o d e eombiniren. Speciell für Lepraschnitte habe ich dies mit Yortheil gethan. Die Schnitte werden zu dem Zwecke, nach der maximalen Entfärbung in Alcohol, nicht in Xylol, sondern (entweder cürect oder nach vorheriger Behandlung mit Wasser) mit dem Spatel auf den Objectträger gebracht, dort dann nach der Unna" sehen Yorschrift an- getrocknet und dann in Balsam eingeschlossen. Auch für D e c k g 1 a s p r ä p a r a t e kann mau die G r a m ' sehe Methode verwenden. Doppelfärbungen, in der oben (p. 111) angegebenen Weise unter Anwendung von Picrocarmin hergestellt, geben hier (bei Ausstrichpräparaten von Gewebssaft etc.) oft die schönsten Bilder. Man geht bei der Färbung von Deckglaspräparaten nach Gram am besten so vor, dass man das (event. mit [vorher filtrirtem ; cf. p. 111, Anm. 1] Picrocarmin vorgefärbte, dann mit Wasser abgespülte und wieder getrocknete) Präparat e. V-2 ^'^finute mit Ehrlieh' scher Gentiana^iolettlösung, dann (ohne es abzuspülen) c. 1 Minute mit der Jodjodkaliumlösung, dann (am besten unter Bewegen) eine Reihe von Minuten — Ins zu maximaler Entfärbung — in Alcohol be- handelt; dann wii"d das Präparat schnell unter dem Strahl der Wasserleitung abgespült, abgeblasen, getrocknet und in Xylolbalsam eingeschlossen. Die Gram' sehe Behandlung bringt bei den Bakterien nur den Protoplasmakörper, nie die Kapseln, gefärbt zur Anschauung. Ausser meiner Modification der G r a m " sehen Methode sind noch mehrere andere Modificationen angegeben worden, unter denen besonders die oben (p. 96) bereits erwähnte Weigert" sehe „Methode zur Färbung von Fibrin und von M i k r o o r g a n i s m e n" i) sieh bewährt und ausgedehnte Anwendung gefunden hat. Weigert färbt den Schnitt in E hr lieh' scher Anilinwassergentianaviolettlösung, spült ihn in Wasser oder Kochsalzlösung ab, bringt ihn dann mit dem Spatel auf den Objectträger, tupft ihn mit Fliesspapier ab, behandelt ihn darauf mit der oben genannten Jodjodkaliumlösung, tupft ihn Avieder ab, betropft ihn mit Anilin (Anilinöl), welches die Diflerenzirimg bewirkt und den Schnitt zugleich entwässert (cf. p. 92, Anm. 1). Dann wird das Anilin mit Xylol entfernt und der Schnitt in Balsam 1) Fortschr. d. Med. ISST. No. 8. IV. Allgemeine Methodik der Bakterienbeobacbtung-. 115 eingeschlosseu. Das Fibrin, Hj^^lin etc. werden bei dieser Behandlung- intensiv blau, die Mkroorganisnien dunkelviolett. U n n a ^j bat empfohlen, die ursprüngliche Gram' sehe Vorschrift dahin abgeändert anzuwenden, dass man das Jod nicht als solches der Jodkaliumlösung zusetzt, sondern dass man dasselbe mit Hülfe von Wasserstoffsuperox}' d, welches der Jodkaliumlösung zugefügt wurde, in die Gewebe einführt. ^) Die Eosaniline und Pararosaniline. (Monatshefte f. prakt. Dermatol. Er- gänzungsheft 1. ISS 7.) V. Allgemeine Methodik der Bakterienzüehtung-. 1. Einleitendes. VV eim es sicli darum handelt, Genaueres über irgend welche Bakterien zu erfahren, die sich in der Natur ii-gendwo uns darbieten, sei es innerhalb des erki'ankten Thierkörpers , sei es innerhalb eines bestimmten Trinkwassers oder an irgend einem anderen Orte, so wird man sich in der Regel nicht damit begnügen dürfen, die Bakterien mikroskopisch zu untersuchen; man würde so weiter nichts feststellen können als ihre Form und ihr Verhalten zu Farblösungen und sonstigen Reagentien. Es würde vielmehr durchaus nothwendig werden, den Versuch zu machen, die Bakterien zur Vermehrung zu bringen, sie zu züchten, zu cultiviren. Erst die Cultur lässt bei vielen mor- phologisch gleichen oder sehr ähnlichen Arten Unterschiede der Arten hervortreten, und für die Diagnosticirung einer bestimmten Art ist die Cultur gewöhnlich gar nicht zu umgehen. Es kann nun vorkommen, dass die Xatur ims im gegebenen Falle die Bakterien bereits in Rein cultur darbietet, d. h. dass sich an dem Fundorte nur einer einzigen Bakterienart angehörige Indivi- duen, unvermischt mit Indi\dduen anderer Arten, vorfinden. In diesem Falle würden wir nichts weiter zu thim haben, als beliebige Theile dieser natürlichen Reincultur auf einen passenden keimfreien, natür- lichen oder künstlichen Nährboden zu übertragen; auf diesem Nähr- boden würde sich die eingesäete Art vermehren, und wir hätten dann durch beliebige Variation der Culturbedingungen Gelegenheit, das Ver- halten der Art unter den verschiedensten äusseren Verhältnissen, mit- hin ihre Eigenschaften nach allen Richtungen hin, zu studiren. Dieser Fall findet sich z. B. häufig dann, wenn es sich um Thierkrankheiten handelt, die durch die Einwanderung einer bestimmten Bakterienart in den Thierkörper und durch die Vermehrung dieser Art im Blute V. Allgemeine Methodik der Bakterienzücbtung. 117 des Thieres bedingt sind. Ein jeder Blutstropfen wird dann eine Rein- ciütui- der bestimmten Bakterienart enthalten. In den meisten Fällen liegen jedoch die Dinge so. dass die Xatur nicht eine Reincultur, sondern ein Gemisch verschiedener B a k t e r i e n a r t e n darbietet. Wollen wir dann Grenaueres über diese Arten erfahren, so müssen wir die Arten von einander zu trennen, die einzelnen Arten von einander isolirt in Reincultur zu gewinnen suchen. Ein methodisches, zielbewusstes Vorgehen in dieser Richtung ist erst durch Rob. Koch ermöghcht worden. Koch's Methoden der Reincultivirung der Bakterien smd derart construirt, dass wir jedesmal die verschiedenen Bakterienarten, die sich in einem be- stimmten Bakteriengemische vorfinden, in isolirten Reinculturen zu ge\\äQnen im Stande sind, falls nur diese Arten auf dem zur Anwendung gebrachten Nährboden und unter den sonstigen bestehenden Bedingungen überhaupt zu gedeihen vermögen. Die Zeit vor Koch arbeitete fast ausschliesslich mit flüssigen Nährböden. Koch schuf den durchsichtigen, festen Nähr- boden. ^In dieser Umwandlung liegt die Basis de r m o d e r n e n Bakteriologie. "^ Ist die Aufgabe gestellt, mit Hülfe eines flüssigen Nähr- bodens die verschiedenen Arten, welche sich in einem Bakterien- gemische vorfinden, von einander zu sondern, in isolii'ten Reinculturen zu gewinnen , so kann dies ' nur so geschehen , dass man aus dem Bakteriengemische eine einzelne Bakterienzelle herausnimmt und diese, unvermischt mit andern Zellen, in ein beliebiges Quantum des vorher keimfrei gemachten flüssigen Nährbodens überträgt. Hat man wirklich nur eine einzelne Zelle übertragen, ist der Nährboden sicher keimfi-ei gewesen, so muss jetzt, falls der Nährboden überhaupt passend ist, eine Reincultur gelingen. Aber wie überträgt man eine einzelne Zelle? Man hat dies durch weitgehende Verdünnungen des Bakteriengemisches mit sterilisirtem Wasser zu ermöglichen gesucht. Man ging mit der Verdünnung so weit, dass auf eine abmessbare Menge der Flüssigkeit der Schätzung nach nur ein einzelner Keim kam. Uebertrug man nun diese Menge der Flüssigkeit, so entstand mit Wahrscheinlichkeit eine Reincultur, da man mit Wahrscheinlich- keit nur einen einzelnen Keim übertragen hatte. Wie aber war eine Controle darüber möglich, dass wirklich nur ein einzelner Keim über- tragen war, dass ihm nicht mechanisch andere anhingen? Wie war es möglich, die Entwickelung der Cultur aus dem einen Keime mikro- skopisch zu verfolgen und es so über alle Zweifel zu erheben , dass man es wirklich mit einer Reincultur zu thun hatte? Alle diese Dinge llg A. Allgemeines. boten so imencUiche Schwierigkeiten, dass an eine nniverselle Anwend- barkeit dieser Methode znm Zwecke der Eeincnltur nicht gedacht werden konnte. L i s t e r i) war übrigens der Erste, welcher mit Hülfe der beschriebenen Verdünnungsmethode^) eine Bakterienremcnltur erzielte, nachdem dieselbe vorher schon von Brefeld für Schimmel- pilze mit Erfolg angewendet worden war. R. Koch hatte bei seiner ersten, grundlegenden Arbeit über die Actio logie des Milzbrandes^) ebenfalls nur flüssige Nähr- böden zur VeiTVTndung. Es gelang ihm hier, mit Hülfe des flüssigen Nährbodens die Entwickelungsgeschichte des Milzbrandbacillus lückenlos darzulegen und an der Hand sicherer Reinculturen seine Pathogenität zu erweisen. Immerhin gehörte das ausserordentliche Geschick eines Koch dazu, die Unzulänglichkeiten des flüssigen Nährbodens zu über- winden und denselben in einwandsfreier Weise dem erstrebten Ziele dienstbar zu machen. Der fundamentale Unterschied zwischen dem flüssigen und dem festen Nährboden ist der, dass der flüssige Nährboden die verschiedenen Bakterienvegetationen, die sich in oder auf ihm bilden, in uncontrolir- l)arer Weise durch einander gerathen lässt, während dieselben, in festem Nährboden wachsend, vermöge der Consistenz des letzteren an Ort und Stelle isolirt von einander fixirt bleiben. Ist nun der feste Nährboden nebenbei noch durchsichtig, so ist eine makroskopische und mikroskopische Controle der verschiedenen Vegeta- tionen in jedem Augenblicke ermöglicht, und damit die Erzielung von Reinculturen eigentlich vollendet. Wir werden uns deshalb zur Isolirung der Bakterien stets des festen Nährbodens bedienen; flüssige Nährböden können nur in Frage kommen, wenn wir bereits Reinculturen vor uns haben. Zur Isolirung der Bakterien, zur methodischen Herstellung von Reinculturen sind also feste, durchsichtige Nährböden er- forderlich. Solche Nährböden erhält man nach Koch's Vorgang durch Zusatz von gelatinirenden Substanzen zu passenden Nähr- lösungen. Da die Bakterien je nach den Arten aber verschiedene Ansprüche an den Nährboden stellen, so wird man sich nicht auf ^) Jos. Li st er. On the lactic fernientation etc. (Patb. Societj' of London Deo. 18. 1877; Transactions 1877/78.) Dort p. 447 beschreibt Lister die Ver- diinnungsmethode, die er anwandte, um aus Milch die säuernde Bakterienart, das „Bact. lactis" reinzuzüchten. ') xVusfiihrlicheres hierüber findet man in Hu eppe 's „Methoden der Bakterien- lorschung". 5. Auil. Wiesbaden. 1891. p. 306 ff. ") Cohn's Beitr. z. Biol. d. Pfl. Bd. 2. 1876. p. 277 ff. V. Allgemeine Methodik der Bakterienzüchtung-. HO eine einzige Nährlösung beschränken dürfen, sondern man muss die Znsammensetzung der Nährlösung je nach dem Bedürfnisse varüren.^) Koch-) construirte sich so verschiedene „Nährgelatinen" durch Zusatz von Gelatine zu Heuinfus, Weizeninfiis, Humor aqueus, Fleisch- extract- und Peptonlösung, Fleischinfus und Peptonlösung, Blutserum. Zur Cultivirung von Pilzen sehr geeignet erwiesen sich mit PÜaumendecoct oder Pferdemistdecoct hergestellte Nährgelatinen. Zur Züchtung von pathogenen Organismen ganz besonders geeignet fanden Koch und Loeffler'^) eine Nährlösung, welche aus Fleischinfus mit Pepton- und Kochsalzzusatz be- steht, und die durch Natriumphosphat oder Natriumcarbonat schwach alkalisch gemacht wird. Diese Pepton -Kochsalz -Bouillon bildet die Basis der wichtigsten Nährböden, welche in dem bakteriologischen Labo- ratorium heutzutage angewendet werden. In Verbindung mit Gelatine bildet sie den gewöhnlich einfach als „Koch' sehe Nährgelatine" bezeichneten Nährboden; in Verbindung mit Agar bildet sie das weiter- hin noch zu besprechende „Nähragar"; ohne Zusatz mrd sie als „ N ä h r 1) u i 1 1 n " angewendet. 2. Die Darstellung der -wichtigsten bakteriologischen Nährböden. Nährgelatine, Nähragar, Nährbouillon, Blutserum, Kartoffel, Ei, Brotbrei etc. Die „Nähr gel atine" wird folgendermassen dargestellt: Man übergiesst 500 g fettfreies gehacktes oder geschabtes Eindfleisch 1 1 destillirtem Wasser ^) Eine Methode, die Bedürfnisse an Nährsubstanzen für einen gegebenen Fall zu ermitteln, hat Beyerinck 1SS9 (cf. Centralbl. f. Bakt. Bd. 7. 1S90. p. 347) angegeben. Er vertheilt eine Eeincultur der Bakterien- (oder Hefen- etc.) Art, deren Bedürfnisse ermittelt werden sollen , in geschmolzener Gelatine oder in Agar , denen die nothwendigen Nährsubstanzen zunächst noch nicht zugesetzt sind, giesst die so beschickte (Jelatine resp. das Agar auf eine Platte etc. aus , lässt das Ausgegossene erstarren und bringt nun auf die Oberfläche der erstarrten Gelatine resp. des Agars an verschiedenen Stellen Tröpfchen von Lösungen verschiedener einzelner Nährsub- stanzen. Die Stoffe diffundiren in die erstarrte Gelatine etc. hinein, und es kommt dort zu dem ausgiebigsten Wachsthum, wo (wie z. B. event. in dem gemeinsamen Diffusionsfeld differenter Tröpfchen) die Nährsubstanzen in der günstigsten Zusammen- setzung vorhanden sind. Es entsteht auf diese Weise eine Entwickelungsfigur auf der Platte, welche Beyerinck „Auxanogramm" nennt; die Methode bezeichnet er als „ Auxanographie". ' • '-) Mitth. aus d. Kais. Ges.-Amte. Bd. 1. 1881. p. 27, 28. •') Mitth. aus d. Kais. Ges.-Amte. Bd. 1. 1881. p. 27 und 109. 120 -^- Allgemeines. und lässt das Gemisch, nachdem man das Fleisch möghchst gleich- massig in dem Wasser vertheilt und hinterher noch mehrmals um- gerührt hat, 12 — 24 Stunden an einem kühlen Orte stehen. Ln Sommer empfiehlt sich hierzu der Eisschrank. Dann giesst man das Gemisch auf ein reines leinenes Tuch, welches über einen grossen Glastrichter hinweggelegt ist, und lässt das „Fleischwasser" hin- durchlaufen. Ist die ganze Menge aufgegossen, so kann man die Zipfel des Tuches zusammennehmen und nun durch vorsichtiges Drücken imd Pressen des Tuches mit der Hand das Durchfliessen der Flüssig- keit beschleunigen. Man presst so lange, bis man 1 1 Fleischwasser erhalten hat. Das Fleischwasser ist eine Lösung der löshchen Sub- stanzen des Muskels; es reagirt in Folge seines Gehaltes an Mlch- säure stark sauer. (Anstatt des Fleischwassers kann auch eine Fleisch- extract-Lösung als Constituens der Xährgelatine benutzt werden; man ninunt 10 g Liebig'sches Fleischextract auf 1 1 Wasser. Die resultirende Nährgelatine ist bräunlich gefärbt, während bei der Ver- wendung von Fleischwasser ein ungefärbter Nährboden erhalten wird). In das Fleischwasser (resp. (üe Fleischextractlösung) hinein wird nun gegeben: 100 g Gelatine (107o), 10 g Pepton (Peptonum siccum) (l^o)' 5 g Kochsalz (VaX)- (Es giebt im Handel viele verschiedene Sorten von Gelatine. Wir ver- wenden fiii- unsere Zwecke die gute weisse Speisegelatine der Küche, die eine gute Erstarrungsfähigkeit besitzt.) Das Gemisch lässt man zunächst etwas stehen, damit die Gelatine aufquillt, und bringt das- selbe dann bei massiger Erwärmung (durch Einstellen in 40 — 50^0. warmes Wasser) zur Lösung. Die Erwärmung soll hierbei niemals so weit gehen, dass das Muskeleiweiss beginnt ausgefällt zu werden. Ist die ganze Menge der Gelatine und des Peptons gelöst, so nimmt man das Neutralisiren des Gemisches vor. Man bedient sich dazu einer gesättigten wässerigen Lösung von Natriumcarbouat, die,. zuerst in grösserer Quantität, dann vorsichtiger, tropfenweise, mit Hülfe einer Pipette so lange zugesetzt wird, bis das Lackmuspapier i) schwache, aber deuthche alkalische Reaction anzeigt. Dann kommt das, am zweckmässigsten in einem gi'ossen Glas- kolben befindliche, Gemisch (dem man — behufs der sichereren Klärung ^) Phenolphtalein oder Eosolsäure sind als Indicatoren hierbei nicht zu be- nutzen. Eine in der Eeaction richtig gestellte, auf Lackmus schwach alkaUsch reagirende Nährgelatiiie zeigt, mit einem der erstgenannten Körper geprüft, saure Eeaction. V. Allgemeine Methodik der Bakterienzüchtung. 121 bei dem nachfolgenden Erhitzen — jetzt noch das Weisse emes [guten, frischen!] Hühnereies zusetzen kann, welches mit der Flüssigkeit ge- hörig durchgeschüttelt wird) in das kochende Wasserbad oder in den Dampftopf (cf. oben p. 28), wo es 1 bis l^o Stunden i) der Erhitzung durch den 100*^ C. heissen Wasserdampf ausgesetzt wird. Hierbei werden die aus dem Muskel stammenden (event. auch das zu- gesetzte Hühnereiweiss repräsentirenden) fällbaren Eiweisskörper aus dem Gemische ausgefällt; sie finden sich dann an den Wänden des Gefässes und auf der Oberfläche der Flüssigkeit schwimmend als zu- sammenhängende Massen vor, während die Flüssigkeit selbst klar erscheint. Die letztere braucht nun nur noch filtrirt zu werden. Das Filtriren geschieht durch eine doppelte Lage gutes Filtrirpapier hin- durch. Man lässt die Flüssigkeit in gut gereinigte sogenannte Erlen- meyer' sehe Kölbchen hineinlaufen. Die Gelatine ist jetzt eventuell (siehe nachher) fertig. Sie muss klar durchsichtig erscheinen und darf sich beim Auf kochen nicht trüben; sie muss schwach, aber deutlich alkalisch reagiren. Nur in seltenen Fällen wird, wenn man die Gelatine genau nach dem vorstehenden Recept angefertigt hat, die chemische Reaction jetzt schon eine zufriedenstellende sein. Hat man nämlich nach der Lösung der Gelatinetafeln und des Peptons in dem Fleischwasser die Reaction des Gemisches auch auf das Sorgfältigste richtig gestellt, so erlebt man es doch ausserordentlich häufig, dass nach dem Kochen die Reaction wieder eine neutrale oder selbst leicht saure geworden ist. Dieses „iST ach säuern" der Nährgelatine beim Kochen scheint bei der einen Gelatinesorte in höherem, bei der anderen in geringerem Grade aufzutreten. Auf jeden Fall darf man sich daher niemals damit zufrieden geben, dass man die Reaction ein Mai richtig gestellt hat, sondern es ist durchaus nothwendig, die Reaction nach dem Kochen wiederum zu prüfen. Am zweckmässigsten ist es, diese Prüfung und event. erneute Richtigstellung vor dem Filtriren vor- zunehmen. Nach der Richtigstellung der Reaction wäre dann erneut kurze Zeit (i/o Stunde etwa) zu kochen, dann zu filtriren. Dass die Nährgelatine die richtige, d. h. eine deutlich alka- lische Reaction zeigt, ist ein g a n z hervorragend wichtiger Punkt; und man darf denselben bei der Darstellung dieses Nähr- ^) Die angegebene Zeit bezieht sich auf den Fall, dass man (wie oben an- genommen) 1 1 des Nährbodens zurecht macht. Handelt es sich um die Darstellung grösserer Quantitäten, so muss, da die Erhitzung hier langsamer vor sich geht, ent- sprechend länger gekocht werden. 122 -•^- Allgeineiues. bodeiis uie aus den Augen lassen. Die Bakterien verlangen ganz im Allgemeinen, wie das schon oben (p. 21) gesagt ^vurde, alkalische Nährböden. Manche Arten, speciell z. B. der Choleravibrio, sind ganz ausserordentlich empfindlich in dieser Beziehung. Falls man daher eine Nährgelatine dargestellt hat, die die vorschriftsmässige Keaction nicht zeigt, so darf man sich nachher nicht wundem, wenn der Choleravibrio nur höchst kümmerlich oder auch gar nicht auf diesem Nährboden gedeiht, der letztere demnach für Cholerauntersuchungen nicht zu brauchen ist. Bezüglich der Bereitung der Nährgelatine ist aber darauf auf- merksam zu machen, dass es sich nicht empfiehlt, die chemische Reaction gleich im Anfange (vor dem Ausfällen der Eiweisskörper) zu stark alkahsch zu stellen. Man wüi'de dadurch nämlich bewirken, dass der nachfolgende lüärungsprocess (beim Kochen) sehr unvollkommen imd schlecht vor sich ginge. Je weniger alkalisch die Fleischwasser- Gelatiue-Pepton-Kochsalz-Lösung ist, desto schneller und besser klärt sie sich bemi Kochen. Im Allgemeinen würde es sich also empfehlen, in dieser Beziehung eine Mittelstrasse einzuschlagen; h. h. man macht zunächst (vor dem Kochen und Klären) die Flüssigkeit nur neutral resp. ganz schwach alkalisch, dann kocht man, und erst nach dem Kochen und der Klärung wird die Reaction deutlich alkalisch eingestellt. Erneutes kurzes Kochen (siehe oben) und darauf folgendes Filtriren würde dann die Operation abschliessen. Genügt die Gelatine den in Vorstehendem ausfiihrUch auseinander gesetzten Anforderungen (erscheint sie nach dem Filtriren klar durch- sichtig, trübt sie sich beim Aufkochen nicht, zeigt sie die richtige Reaction), so kann sie in Reagenzgläschen eingefüllt werden, in welchen sie dann vorläufig, bis wir sie in Gebrauch nehmen, ver- bleibt. Nach der ursprünglichen Koch'schen Vorschrift werden die zu benutzenden Reagenzgläschen zunächst sauber mit "Wasser und Bürste gereinigt, dann an der Luft getrocknet und nun mit je einem Wattepfropf,^) der in die Oeffnung fest eingedreht wird, und durch den ein „pilzdichter" Verschluss des Gläschens herbeigeführt werden soll, versehen. Die Gläschen gelangen dann in einen in den Heissluft- oder Trocken schrank (cf. p. 27) passenden Einsatz von Drahtgeflecht („Draht korb"), welcher in den Trockenschrank ^) Auf die Herstellung des "Wattepfropfs hat man gehörige Sorgfalt zu verwenden. Es genügt nicht, irgendwie ein Stückchen Watte in den Hals des Röhr- chens zu stopfen, sondern man muss dazu ein zusammenhängendes Stück "Watte nehmen ; die äussere Fläche des fertigen Wattepfropfs muss (an den Seiten und unten) eine möglichst continuirliche Schicht bilden. V. Allgemeine Methodik der Bakterienzüclitung. 123 gestellt wird. Hier werden die Gläschen ^/g bis "^/^ Stunden einer Temperatur von etwa 150^ C. ausgesetzt. Sie werden hierbei sammt dem Wattepfropf, der bei dieser Procedur eine leicht bräunliche Färbung (beginnende Verkohlung) annimmt, gründlich sterilisirt. Nach der Erhitzung lässt man die Gläschen erkalten. Sie sind nun gebrauchs- fertig. Man nimmt Gläschen für Gläschen in die Hand, entfernt den Wattepfi'opf, dessen innerhalb des Röhrchens befindlich gewesenen Theil man sorgfältig vor Berührung mit den Händen und anderen Dingen schützt, und giesst aus dem E r 1 e n m e 3?^ e r ' sehen Kölbchen die flüssige Gelatine in einer Menge von je etwa 10 ccm in das vertikal gehaltene Reagenzröhrchen so, dass eine Benetzung des oberen Theiles der Wand des Röhrchens sorgfältig vermieden wird. Verfehlt man dies, so klebt nachher der Wattepfropf an der Wand an und muss dann später los- gerissen werden, was immer Unannehmhchkeiten mit sich führt. Nach dem Eingiessen der Gelatine "v^nrd der Pfropf wieder aufgesetzt resp. eingedreht, und das Gläschen dann zunächst in das Reagenzglasgestell bei Seite gestellt. Nach dem Vorgange mehrerer anderer Autoren habe ich (ab- weichend von der vorstehend angegebenen ursprünglichen Koch "sehen Vorschrift) das Sterilisiren der Reagenzgläser vor dem Einfüllen der Gelatine seit Jahren ganz weggelassen. Ich stelle mir die gut gereinigten und getrockneten Gläschen neben ein- ander auf das Reagenzglasgestell, fülle sie nach der Reihe mit Gelatine, versehe erst jetzt jedes einzelne mit einem (unsterilisirten) Wattepfropf und behandle sie dann, wie folgt, weiter. ^) Sind alle Gläschen (unter Befolgung der ursprüngHchen Koch'- schen Vorschrift oder der angegebenen Modification) mit Gelatine be- schickt, so kommen sie zusammen in den Einsatz des Dampftopfes und njit diesem für 15 — 20 Minuten in den Dampf von 100 C. Dann werden sie aus dem Dampftopf entfernt, zur Abkühlung hin- gestellt, bis zum nächsten Tage stehen gelassen, und gelangen nun von Neuem auf 15 — 20 Minuten in den Dampftopf. Dies wird dann auch noch ein drittes Mal, 24 Stunden später, wiederholt. Bei dieser Behandlung wird die Gelatine sterilisirt.-) Der Grund dieser ^) Ebenso verfahre ich bei der Agarbereitung und bei der Bouillonbereitung, ebenso auch , wenn es sich um Kartoffelculturen im Keagenzglase handelt. Für Blutserumröhrchen ist dieses abgekürzte Verfahren nicht anwendbar; denn die (bei den anderen Nährböden nach der EinfiÜIung folgende) Sterilisirung im Dampftopf ist bei Blutserum nicht angängig. -) Hat man die Gelatine in vorher nicht sterilisirte Gläschen eingefüllt, so wird bei dieser Behandlung im Darapftopf auch das Gläschen und der Wattepfropf sterilisirt. 124 A. Allgemeines. mehrmaligen, miterbrochenen, „discontinuir liehen" Erhitzmig ist folgender: In der Gelatine sind zunächst Keime vorhanden, welche zerstört werden sollen. Die Keime können z. Th. in Form vegetativer Zellen, z. Th. in Form von Dauersporen vorhanden sein. Die ersteren sind durch Erhitzung schnell und leicht zu tödten, die letzteren aber würden zu ihrer Tödtung eines viele Stunden fortgesetzten Kochens benöthigen. Eine so lange auf Siedetemperatm- gehende Erhitzung verträgt aber die Gelatine nicht. Die Gelatine hat die Eigenthüm- lichkeit, durch langdauemdes Erhitzen ihre Erstarrungsfähigkeit mehr und mehr eiuzubüssen. Wir ^vürden also, wollten wir die Gelatine durch einmaliges Kochen sicher sterilisiren, einen flüssigen IS^ährboden, und. nicht einen festen, den wir haben wollen, erzielen. Man begnügt sich daher zunächst damit, die vegetativen Formen abzutödten. Bis zum nächsten Tage sind dann in der wieder abgekühlten Gelatine die vorhandenen Sporen ausgekeimt, und es sind also jetzt keine Sporen mehr da, sondern nur vegetative Formen, die durch erneutes kurzes Erhitzen wieder leicht und sicher zu tödten sind. Um ganz sicher zu gehen, erhitzt man auch noch ein drittes Mal in dieser Weise. Dann hat man sicher keimfreie Gelatine, i) Das Princip dieser ,, d i s c o n - tinuir liehen Sterilisation" wurde von Tyndall erfunden. Die angegebene Nährgelatine kann man als die „ N ä h r g e 1 a t i n e p a r e X c e 1 1 e n c e" bezeichnen : spricht man von „Nährgelatine" schlecht- hin, so meint man stets diesen Nährboden, Oben (p. 119) haben wir schon angegeben, dass bereits Koch sich für bestimmte Zwecke anders zusammengesetzte Nährgelatinen hergestellt hat; und in der Folge, nach den ersten Koch' sehen Arbeiten , hat es sich als nothwendig erwiesen, auch für die Züchtung von pathogenen Bakterien, für die ja die gewöhnliche Koch' sehe Fleischwasser-Pepton-Kochsalzgelatine im Allgemeinen ganz besonders geeignet ist (cf. p. 119), die Zusammen- setzung der Nährgelatine gelegentlich etwas abweichend zu gestalten. Es handelt sich hier hauptsächlich um gewisse Zusätze, die man der gewöhnlichen Nährgelatine in der Praxis für den einen oder den anderen Zweck giebt. In Folgendem seien die am häufigsten angewandten, hierhin gehörigen Modificationen der Koch' sehen Nährgelatine an- gegeben. T r a u b e n z u c k e r - G e 1 a t i n e. Man setzt der fertig hergestellten. ^) Unter Umständen können — allerdings sind das sehr seltene Aus- nahmen — an den Gelatinetafehi des Handels äusserst widerstandsfähige Keime vorhanden sein, welche es verursachen, dass eine sichere Sterilisirung der Nähr- gelatine nach der geschilderten Methode nicht gelingt, (cf. Heim, Centralbl. i. Bakt. Bd. 13'. 1893. No. 20.) V. Allgemeine Methodik der Bakterienzüchtung. 125 bereits filtrirten, aber noch nicht in Reagenzgiiischen eingefüllten, Nährgelatine 2 ^j^ Tranbenzucker zu (d. h. auf 1 1 Gelatine 20 g), löst auf, füllt in Reagenzgläschen ein und sterilisirt im Dampftopf, wie oben angegeben.^) Milchzucker- Gelatine. Sie wird genau so dargestellt wie (üe Ti-aubenzucker-Gelatine. Man nimmt 2 ^j^ Milchzucker, welchen man der fertigen Nährgelatine zusetzt. 3proc. Kochsalz-Gelatine. Man stellt sich eine Nähr- gelatine genau in der Weise, wie oben (j). 119 ff.) geschildert, her; nur nimmt man 3 ^J^ Kochsalz anstatt ^/^ ^Iq-') Die vorstehend genannten, mit 10 ^/^ Gelatine hergestellten Gelatine- Nährböden haben die Eigen thümlichkeit, bei etwa 24 "^ C. weich zu werden und bei etwas höherer Temperatur zu schmelzen. Man kann sie deshalb nur bei „Zimmertemperatur", d. h. höchstens bei einer Temperatur von 22 ^ C. zu Culturzwecken verwenden, will man sich nicht des Vortheils des festen Nährbodens begeben. Dadurch nun, dass man den Gelatinezusatz bei der Bereitung des Nährbodens erhöht, die Nährgelatine also concentrirter macht, gehngt es Nährböden her- zustellen, die erheblich höhere Temperaturen (bis zu 30 ^ C.) aushalten, ohne ihre feste Consistenz zu verlieren. Solche Nährgelatmen (bei deren Herstellung resp. Sterihsirung alle und jede nicht absolut nothwendige Erhitzung streng vermieden werden muss, da die Gelatine, je mehr erhitzt, desto mehr an Erstarrungsvermögen einbüsst [cf. oben p. 124]) haben Pane^) (1892) sowie Eisner*) (1894) angegeben. Die Darstellung des Nähr -Agar erfordert ein von der ') Es empfiehlt sich nicht den Traubenzucker gleich zu Anfang, d. h. mit dem Pepton imd Kochsalz zusammen, der Flüssigkeit zuzusetzen; denn bei dem nach- folgenden längeren Kochen wird der Traubenzucker, wie bekannt, allmählich immer mehi- und mehr verändert, und es wird dadurch der Zweck, einen Nährboden von bestimmtem Traubenzuckergehalt zu bekommen, vereitelt. ^) Die 3proc. Kochsalz - Gelatine findet besonders zur Züchtung von Leucht- bakterien Verwendung. Braucht man nur einige Eöhrchen derartiger Gelatine, welche man sich aus bereits vorhandener gewöhnlicher Nährgelatine herstellen will, so kann man zweckmässig 'so verfahren , dass man etwas Kochsalz in einem leeren Eeagenz- glas über der Bunsenflamme stark erhitzt, so dass es seinen Wassergehalt verliert und sterilisirt wird. Zu gleicher Zeit erhitzt man auch das Eeagenzglas m allen seinen einzelnen Theilen stark, um es völlig steril zu machen. Man hat dann weiter nichts zu thun, als von dem sterihsirten Kochsalz eine kleine Quantität in ein Gläs- chen mit Nährgelatine, dessen offenes Ende man nach Entfernung des Wattepfropfs in der Flamme stark erhitzt hat, überzugiessen, um es (nach Aufsetzung des Watte- pfropfs) in der dann geschmolzenen Gelatine gleichmässig zu vertheilen. ^) cf. Centralbl. f. Bakt. Bd. 16. p. 229. Anm. ^) Hjg. Rundschau 1894. p. 296; Arch. f. Hyg. Bd. 21. 1894. p. 140. 126 A. Allgemeines. Darstellung der Xährgelatine etwas abweichendes Vorgehen. Das Agar odor Agar-Agar ist eine Pflanzengallerte, von verschiedenen Arten ostindischer Meerestange stammend. Das Agar kommt in Form von Streifen oder von Pulver oder auch von grösseren vierkantigen Stücken, die aus lose zusammenhängender dünner Agarmasse bestehen,^) in den Handel. Das Agar quillt in Wasser auf, schmilzt aber im Gegensatz zur Gelatine, welche gewöhnlich bereits zwischen 25 ^ und 30 ^ C. flüssig wird, erst bei Temperaturen, die der des kochenden Wassers nahe kommen. Die geschmolzene Agarlösung erstarrt dann bei etwa 40 ^ C. wieder. Zur Darstellung des N^ähr-Agar geht man wieder von dem Fleischwasser aus, welches man sich in derselben Weise, wie oben (p. 119) bei der Bereitung der Nähr- gelatine angegeben, darstellt. (Statt des Meischwassers kann man, wie bei der Herstellung der IS'ährgelatine, auch eine 1 proc. Lösung von Liebig' schem Fleischextract nehmen.) Man setzt dann zu 1 1 Fleischwasser 10 g Pepton (1%) und 5 g Kochsalz (Vs^/o)- Diese ^Mischung bringt man nun zunächst, ohne sie vorher zu neutrali- siren, etwa für eine Stunde in den Dampftopf: hier werden die fäll- baren Eiweisskörper ausgefällt. Man filtrirt die Flüssigkeit dann durch Filtrirpapier. Zu der Flüssigkeit, welche nun frei ist von durch Hitze ausfällbaren Eiweisskörpern, setzt man 10 bis höchstens 20 g Agar (1 bis höchstens 2 *^/o)-) entweder in Pulverform oder in kleinen Stückchen, die man durch Zerschneiden der Streifen etc. gewonnen hat, und bringt nun das Gemisch aufs Keue in den Dampf topf oder auch über die offene Flamme, bis sämmtliches Agar ge- schmolzen ist. Die homogene Flüssigkeit wird nun mit Hülfe von gesättigter Sodalösimg (wie dies [oben p. 120] bei der Gelatine ge- schah) auf leicht alkalische Eeaction gebracht") Dann wird noch einmal gründhch gekocht, am besten mehrere Stunden lang, und dann wird die Masse durch eine doppelte Lage Filtrirpapier, oder, was ^) Diese vierkantigen Stücke sind das reinste und daher am meisten zu empfehlende Präparat. -) Gewöhnlich nimmt man iVa'^/o- '■'} Zu diesem Zwecke ist gewöhnlich ein viel geringerer Sodazusatz nothwendig, als es bei der Nährgelatine der Fall ist; der Grund ist der, dass die käufliche Gelatine an sich sauer reagirt, das Agar aber nicht. Uebrigens kommt es bei der Nähi-gelatine (die zur Züchtung pathogener Bakterien Verwendung finden seil) viel mehr darauf an, die Reaction richtig einzustellen, als bei dem Xähragar. Auf dem Nähragar nämlich züchten wir die pathogenen Bakterien gewöhnlich bei Brüttemperatur, d. h. bei ihrem Temperaturoptimum, während wir die Gelatinecultureu bei Zimmer- temperatur, d. h. bei Temperaturgraden, die den pathogenen Arten weniger günstig sind, halten müssen. Sind aber die Züchtungsbedingungen in mancher Hinsicht (im V. AJlgemeine Methodik der Bakterienzüchtung. 127 sehr zweckmässig ist, durch Flanell filtrirt. Hierzu wird man sich stets des Heisswassertrichters ') bedienen müssen. Man kann auch die Fil- tration ganz und gar im Dampftopf geschehen lassen. Das Agar- filtriren ist aber ein mühsames Geschäft, da die Agannasse sehr lang- sam durch das Filter läuft: und man hat sich deshalb auf andere Weise möglichst klare Agarlösungen zu verschaffen gesucht. ^) Vielfach angewendet wird ein (von A. Fränkel") angegebenes) einfaches Ver- fahren, welches darauf beruht, dass man die Agarlösung in ein hohes Cylindergefäss giesst und das letztere so disponirt, dass sich die Lösung nur ganz allmählich abkühlen kann. Recht gut erreicht mau dies, wenn man die aus dem Dampftopf kommende, 100 o C. heisse, Agar- lösung, nachdem man sie in ein derartiges Gefäss gebracht hat, mit demselben in den Dampftopf zurückstellt, den man nun, ohne ihn weiter zu heizen, der allmählichen Abkühlung überlässt. Es senken sich dann in der Lösung die in ihr suspendirten Präcipitate zu Boden, während die darüber befindliche Lösung mehr und mehr klar Avird. Man findet dann nach dem Erstarren eine feste Agarmasse, die in ihren unteren Theilen die Präcipitate einschüesst, während die oberen klar sind. Die Masse wird nun, eventuell dm'ch leichtes Erwärmen des Glases, aus dem letzteren mi Ganzen herausgeholt; die trüben Theile des Agarcylinders werden durch einen Messerschnitt von den klaren getrennt, die letzteren zerkleinert, wieder geschmolzen, und es wird dann der so gewonnene fertige Nährboden in einzelne Reagenz- letzteren Falle also, was die Temperaturverhältnisse angeht) weniger günstig, so muss darauf gesehen werden, dass im Uebrigen die Ansprüche der zu cultivirenden Art mögUchst erfüllt werden (cf. auch die Beispiele auf p. 24, 25 oben). Zu diesen Ansprüchen gehört aber bei den pathogenen Bakterien im Allgemeinen eine leicht alkalische Eeaction des Nährbodens. 1) Unna (Centralbl. f. Bakt. Bd. 9. 1891. No. 23) hat einen „Dampf- trichter" zum Agarfiltrireu construirt. Derselbe arbeitet bei Temperaturen etwas über lOO** C. ; die Agarlösung ist während des Filtrirens dauernd von Dampf um- geben. Man kommt mit dem vierten Theil der Zeit aus, die man sonst zum Agar- filtrireu braucht. -) Tischutkin (cf. Centralbl. f. Bakt. Bd. 9. 1S91. p. 208) hat empfohlen, das Agar (vor der Lösung) in dünner (.öproc.) Essigsäure einzuweichen, dann in Wasser zu waschen und darauf erst in die BouiUon behufs der Auflösung zu bringen. Die Lösung geht dann schnell vor sich, und auch die Filtration des so hergestellten Nährbodens geschieht schnell und leicht. Wie jedoch N. K. Schultz (Centralbl. f. Bakt. Bd. 10. 1891. p. 58) hervorhebt, gewinnt man durch diese Methode nichts. Das Erstarrungsvermögen des Agar wird nämlich durch die Einwirkung der Säure herabgesetzt und kann auch durch nachträgliches Neutralisiren nicht wiedei' her- gestellt werden. 3) Zeitschr. f. klin. Med. Bd. 10. lSb6. p. 415, Anm. 128 A. Allgemeines. gläschen, wie dies bei der Gelatinebereitimg geschah, eingefüllt. Darauf erfolgt das Sterilisiren der gefüllten Eeagenzgläschen , welches man zweckmässig genau wie das der Gelatineröhrchen, d. h. durch je 1 5 — 20 Minuten lange Behandlung im Dampftopf an drei auf einander folgenden Tagen, bewerkstelligt. — Zur Klärung der Agarlösung hat neuerdings Haegler^) die Centrifuge vorgeschlagen. Für manche Zwecke ausgezeichnet ist ein Zusatz von etwa 6 ^/^ G 1 y c e r i n zu dem Xähragar. Einzelne pathogene Bakterienarten, z. B. Diphtheriebacillen, Streptococcen, gedeihen besser auf dem glj'cerin- haltigen Nährboden als auf dem glycerinfi-eien ; und die Tuberkel- bacillen wachsen sogar auf dem glycerinhaltigen Agar (gewöhnlich einfach „Glycerin-Agar" genannt) ausgezeichnet, während sie auf gewöhnlichem Agar nur äusserst kümmerlich wachsen. Das Glycerin setzt man bei der Agarbereitung am besten dem filtrirten resp. ge- klärten Nährboden vor der Einfüllung m die Gläschen zu ; im Uebrigen verfährt man dann, wie oben angegeben. Ferner ist füi' manche Zwecke (z. B. zur Cultivirung von Anaeroben [siehe weiter unten], zur Züchtung von Hefen etc.) ein Zusatz von etwa 2 °/o Traubenzucker zu dem Nähragar sehr zu empfehlen („Trauben- zucker-Agar"). In ähnlicher Weise kann man auch Milchzucker- Agar herstellen; auch hier ninmit man zweckmässig 2^0 des Zuckers als Zusatz. Selbstverständlich ^m-d man — genau wie bei der Her- stellung der Zucker-Gelatinen (cf. p. 124) — auch bei der Herstellung der Zucker-Agar-Nährböden den Zucker erst dann den resp. Nähr- flüssigkeiten zusetzen, wenn die letzteren im Uebrigen fertig und namentlich auch bereits filtrirt sind. Auch Mischungen von Blutserum und Agar werden gelegentUch zu Culturzwecken verwendet („Blutserum-Agar"). -) Auch kommt für manche Zwecke Agar zur Verwendung, welches mit frischem Blut bestrichen ist („Blut-Agar"). ■^) Das Nähragar imterscheidet sich in mehreren Beziehungen sehr wesentlich von der Nährgelatine. Während die Nährgelatme schon bei Temperaturen wenig über 25 *^ C. flüssig wird, zu Züchtungen bei Brüttemperatur also nicht gebraucht werden kann, eignet sich das Nähragar für diese Züchtungen ganz vortrefflich. Ein zweiter wesent- ') Centralbl. f. Bakt. Abth. 1. Bd. 17. 1895. p. 55S. — Der Autor centri- fugirt die Agarlösung in einem schüsseiförmigen Gefäss. Das Centrifugiren mnss so lange fortgesetzt werden, bis die Masse erstarrt ist. -) Siebe hierüber den nächsten Abschnitt (V, 3.): Verwendung von Blutserum zu Plattenculturen, sowie die dem Gonorrhoecoccus gewidmete Besprechung. ^) Siehe hierüber hinten die Besprechung des Influenzabacillus. V. Allgemeine Methodik der Bakterienzüchtung. 129 licher Unterschied ist der, dass das Agar kein Eiweisskörper ist wie die Gelatine, sondern ein den Kohlehydraten nahestehender Körper. CDas Agar ist also nicht peptonisirbar wie die Gelatine ; es wird durch Bakterien, welche die Gelatine verflüssigen (cf. oben p. 41) nicht verflüssigt."^ Die (mit Nährgelatine oder mit Nähragar beschickten) Reagenz- gläschen lässt man nach vollendeter Sterilisirung entweder in vertikaler Stellung abkühlen, oder aber, und dies empfiehlt sich besonders bei den Agarröhrchen, man lässt dieselben in schräger Lage abkühlen, so dass der Nährboden mit einer Oberfläche erstarrt, die mit der Längsachse des Gläschens einen sehr spitzen Winkel bildet („Schräg erstarrter Nährboden"). Man hat dann eine möglichst ausgedehnte Oberfläche des Nährbodens für Oberflächenimpfungen zur Verfügung. Beim Er- starren presst das Nähragar Wasser aus („Condensationswasser"), welches sich später in den abhängigen Theilen des Röhrchens ansammelt. Die Nährbouillon wird in der Weise dargestellt, dass man zu 1 1 Fleischwasser, welches, wie oben (p. 120) angegeben, dar- gestellt ist, oder zu 1 1 einer 1 proc. Fleischextractlösung (cf. p. 120), 10 g Pepton (1 ^/J und 5 g Kochsalz ('/-2 ^/o) zusetzt und nach der Auflösung dieser Zusätze die Reaction des Gemisches mit ge- sättigter Natriumcarbonatlösung schwach alkalisch i) macht. Hierauf wird (event. nach Zusatz des Weissen eines Hühnereies) 1 — 2 Stunden im Dampf topf gekocht, filtrirt, die fertige Bouillon dann in einzelne Reagenzgiäschen zu je etwa 10 ccm eingefüllt. Die Gläschen Averden darauf, genau wie dies bei Gelatine und bei Agar geschah, sterilisirt. Wie bei der Nährgelatine und bei dem Nähragar, so ist auch bei der Nährbouillon der Zusatz von Glycerin (6 ^/o) resp. von Trauben- zucker (2 ^Iq) oder von Milchzucker (ebenfalls 2 "/q) für manche Zwecke vortheilhaft. Man setzt auch hier die genannten Köii^er der Flüssigkeit erst zu, nachdem die letztere fertig hergestellt und namentlich auch filtrirt ist. Man erhält so eine .,Glycerin-Bouillon", eine „T r a u b e n zu c k e r - B u i 1 1 n'', eine „M i 1 o h z u c k e r - B o u i 1 1 o n". Die mit Zucker versetzte Bouillon gelangt hauptsächlich dann zur Verwendung, wenn es sich um die Feststellung des Gährungsvermögens einer bestimmten Bakterienart handelt. Der flüssige Nährboden wird ^) Man hüte sich ja davor, die Eeaction der Nährbouillon zu stark alkalisch zu stellen; in solchem Falle nämlich wird es fast zur Unmöglichkeit, einen klaren Nährboden zu erhalten (cf. p. 122). Uebrigens steht es bezüglich der chemischen Eeaction, die die Nährbouillon haben soll, genau so wie beim Agar (cf. p. 126, Anm. 3): Bei den beiden genannten Nährböden ist es viel weniger streng erforderlich, die Reaction in ganz bestimmter Weise einzustellen, als bei der Nährgelatine. Günther, Bakteriologie. 4. Auflage. 9 130 ^- Allgemeines. in solchen Fällen am besten nicht in Eeagenzgiäschen , sondern in sogenannte Gährungskölbchen eingefüllt. Diese Kölbchen, welche in physiologisch-chemischen Laboratorien seit langer Zeit in Grebrauch sind, wurden in die bakteriologische Praxis dnrch Th. Smith i) ein- geführt. Sie besitzen einen offenen Schenkel, durch Avelchen sie ge- füllt und geimpft werden, und einen geschlossenen, in welchem sich bei der Cultur die durch die Gährung gebildeten Gase ansammeln. Will man ein Gährungskölbchen für bakteriologische Zwecke zurecht machen, so füllt man es durch den offenen Schenkel mit Zuckerbouillon, indem man durch Neigen die Luft aus dem geschlossenen Schenkel verdrängt und sie durch den flüssigen Nährboden ersetzt. Man ver- schliesst dann den offenen Schenkel mit einem Wattepfi'opf und bringt das Kölbchen ziu' Sterilisirung an drei auf einander folgenden Tagen für je 15 — 20 Mümten in den Dampftopf (in derselben Weise, wie dies bei den zu sterilisirenden Reagenzgläsern geschieht).-) Zum Zwecke der Bereitung des Blutserums als Nährboden für Mikroorganismen verfährt man am besten so, dass man das Blut aus den Adern des Thieres direct in grössere sterile Gefässe (sterilisirte Glasc3dinder) strömen lässt. Es gelingt dann häufig, das Blut ganz keimfrei aufzufangen.'^) Man lässt nun das Blut an einem kühlen Orte stehen. Nachdem sich dann das Serum von dem Blutkuchen getrennt hat, wird das Serum mit sterilisirter Pipette abgehoben und in Eeagenzgiäschen (zu je etwa 10 ccm) eingefüllt, die vorher sammt dem Wattepfi-opf gut sterilisirt wurden (cf. p. 122). Darauf werden die gefüllten Gläschen in einen doppelwandigen Kasten von Zinkblech ge- legt, dessen Boden nicht horizontal, sondern etwas gegen die Horizontale geneigt ist, und in welchem der Zwischenraum zwischen den beiden Wandungen durch Wasser ausgefüllt ist. Die Gläschen liegen hier so, dass das Blutserum mit seiner Oberfläche einen sehr spitzen Winkel mit der Längsachse des Gläschens bildet. Li dieser Lage wird nun das Blutserum zur Erstarrung gebracht, und zwar geschieht dies bei einer Temperatur von 65—68 ^ C, die man durch Erhitzung des Wassers von der Bodenfläche des Kastens her erreicht. Bei dieser Temperatur erstarrt, wie Koch") fand, das (Rinder-) Blutserum zu einer ^) Centralbl. f. Bakt. Bd. 7. 1S90. :No. 16. ") Nach der ersten Erhitzung muss man darauf sehen, dass die Luftblase, welche sich in dem geschlossenen Schenkel angesammelt hat (dieselbe repräsentirt die in dem Nährboden gelöst gewesene Luft, die durch die Erhitzung ausgetrieben wurde) durch Neigen des Kölbchens entfernt werde. ^) R. Koch, Mitth. a. d. Kais. Ges.-Amte. Bd. 2. 1884. p. 47. ^) 1. c. p. 47, 48. V. Allgemeine Methodik der Bakterienzüclitung. 131 durchsichtigen homogenen Masse. Geht man mit der Temperatur höher, über 70 *^ C, so kommt keine klare, durchsichtige, sondern eine trübe Masse zu Stande. Die fertigen Gläschen werden nun auf ihre Sterilität dadurch geprüft, dass man sie mehrere Tage bei Brüttemperatur stehen lässt. Zeigen sie dann keine Entwickelung von Bakteriencolonien, so sind sie steril und gebrauchsfähig. Man gebraucht diese Blutserum- röhrchen zu Oberflächenhnpfungen. Aus diesem Grunde liess man sie auch in schräger Lage erstarren; das Blutserum bietet so eine mög- lichst grosse Oberfläche dar. — Für manche Zwecke, besonders zur Anlegung sogenannter Blutserumplatten (siehe den nächsten Abschnitt), ist es nothwendig, das Blutserum nicht iii erstarrtem, sondern in flüssigem Zustande aufzubewahren. Die mit dem Serum beschickten Röhrchen werden zu diesem Zwecke, ohne dass man sie vorher der Erstarrungstemperatur aussetzt, behufs Prüfung der Sterilität in den Brütschrank gestellt. Haben sie die Probe bestanden, so sind sie zu jederzeitigem Gebrauche fertig A^orbereitet. — Hat man keine Sicherheit, dass das Blutserum bei der Entnahme aus dem Thierkörper steril aufgefangen wurde, so muss man es, nachdem es zur Erstarrung gebracht \mrde, oder auch vorher, besonders sterilisiren. Dies geschieht nach K o c h , i) indem man die Röhrchen 6 bis 8 Tage lang täglich ein bis zwei Stunden einer Temperatur von etwa 56 ^ C. aus- setzt. Es findet hier nach demselben Prmcipe, welches wir bei der Gelatine, bei Agar und Bouillon angewendet haben, eine SteriHsirung statt. Auch das Blutserum wird unter Umständen mit Zusätzen versehen, z. B. Glycerin. Koch-) empfahl auch eine Blutserum-Gelatine zu Culturzwecken. In seltenen Fällen wii'd menschliches Blutserum als Nähr- boden nothwendig. Nach Bumm's Vorgang gewinnt man dasselbe zweckmässig aus Placenten. ■^) Die bis jetzt besprochenen Nährböden haben wii- nach der Be- reitung in Keagenzgiäschen eingefüllt und können sie nun aufbewahren, bis wir sie benutzen wollen. Der Wattepfropf verhindert das Hinein- gelangen von Bakterien- und sonstigen Keimen in den steril ge- machten Nährboden, und der letztere bleibt uns also dauernd zur Verfügung — bis er durch Austrocknen, was ganz allmählich erfolgt, unbrauchbar wird. In ähnlicher Weise kann man sich nun auch die (für Züchtung 1) 1. c. p. 48. 2) Mitth. a. d. Kais. Ges.-Amte. Bd. 1. 1881. ■^) Deutsche med. Wochenschr. 1S85. p. 910. 132 A. Allgemeines. von Bakterien zuerst von Schröter') benutzte) gekochte Kar- toffel als Nährboden füi- bakteriologische Zwecke vorräthig halten. Wir werden die hierzu angegebenen Methoden noch besprechen (cf. p. 134). Nach der ursprünglichen Methode von Koch macht man die Kartoffel immer erst kurz vor dem Gebrauche zurecht. Man ver- fährt hierbei so, dass man die Kartoffel-) unter dem Strahle der Wasserleitung mit einer harten Bürste, sog. Kartoffelbürste, zu- nächst mechanisch von allem äusserhch anhaftenden Schmutz, von Erdpartikelchen u. s. w. gründlich befreit. Die Kartoffel stammt aus der Erde, und in der Erde sind, wie wir bereits früher (p. 28) mit- getheilt haben, Bakterienkeime von ganz ausserordentlich grosser Resistenz vorhanden. Diese müssen also zunächst möglichst beseitigt werden. Die so mit der Bürste gereinigte Kartoffel ^Wrd dann einer genaueren Inspection unterzogen; und es werden hierbei mit Hülfe eines gewöhnlichen, in der Küche gebräuchlichen Kartoffelschälmessers („Kartoff elmesser") die Vertiefungen der Kartotfeloberfläche, die „Augen" der Kartoffel, sowie alle etwa schadhaft erscheinenden Theile der Oberfläche ausgekratzt. Man benutzt hierbei die Spitze des Messers, welches man mit seiner Ebene senkrecht zur Kartoffeloberfläche auf die letztere aufsetzt. Wir müssen hierbei soviel der Augen resp. der schadhaften Stellen entfernen, dass von der Kartoffel nur gesundes Gewebe und gesunde Epidermis zurückbleibt. Erstrecken sich grössere krankhafte Stellen in die Kartoffel hinein, so ist die Kartoffel zu ver- werfen. Man hüte sich, zu tief in die Kartoffel hinein zu schneiden, weil die Kartoffel hinterher in Sublimatlösung gelegt wird, und ein- dringendes Sublimat die Kartoffel für Xährzwecke ungeeignet macht. Auch schone man die gesunde Epidermis möglichst. Ist die Kartoffel mit dem Messer gesäubert, so gelangt sie nach Abspükmg mit Wasser auf ^/g bis 1 Stunde in eine 7ioP^'***^^'^%^ Säuresublimatlö sung (1 Sublimat, 5 Salzsäure. 1000 Wasser)") (cf. oben pag. 33). Dann 1) F. C oh n 's Beitr. z. Biol. d. Pfl. Bd. 1. Heft 2. ls72. p. 111. '-) Nicht alle Kartoffelsorten sind für Culturzwecke gut zu verwenden. Man wählt am besten sogenannte ,,Salatlcartoffeln", die beim Kochen nicht platzen und, in gekochtem Zustande durchschnitten, keine ,, mehlige",, sondern eine feste, glänzende Schnittfläche zeigen. ") Zweckmässig hält man sich als Stammflüssigkeit eine mit Salzsäure her- gestellte 20procentige Sublimatlösung (2(1 g Sublimat, gelöst in Salzsäure bis zum Gesammtvolumen von 100 ccm) vorräthig. Von dieser Stammflüssigkeit nimmt man 5 com und füllt dieselben mit Leitungswasser bis zu 1 1 auf: So erhält man die Vio procentige Lösung für den Gebrauch. — Zur Prüfung darauf, ob eine Sublimat- lösung genügende Quantitäten Sublimat gelöst enthält, bedient man sich nach E. Koch V. Allgemeine Methodik der Bakterienzüchtung. 133 wird die Kartoffel aus der Subliniatlösmig lieraiisgenommen und, nachdem sie in den Einsatz des Dampftopfes gelegt worden ist, mit demselben auf ^2 ^i^ '7* Stunden in den Dampf topf gebracht. Hier wird die Kartoffel gar gekocht und zugleich endgültig steriKsirt. Nun wird der Einsatz aus dem Dampftopf herausgenommen und zu- nächst zur Abkühlung hingestellt. Ist die Abkühlung einigermassen erfolgt, so werden die einzelnen Kartoffeln mit 2 oder 3 Fingern der mit Seife gut gewaschenen und dann in Subhmatlösung getauchten linken Hand aus dem Einsatz herausgenonmien und mit Hülfe eines in der rechten Hand gehaltenen, zunächst „ausgeglühten" (cf p. 26) und darauf wieder erkalteten Kartoffelmessers durchschnitten, um dann sofort in eine (noch zu beschreibende) feuchte Kammer ge- legt zu werden. Bei dem Herausnehmen der Kartoffeln mit Hülfe der „ Sublimat finger" aus dem Einsatz des Dampftopfes hat man zu- nächst darauf zu sehen, dass die Kartoffeln nicht mehr als nöthig mit Sublimatlösung beträufelt werden. Dann ist zu beachten, an Avelchen Stellen die Kartoffel ergriffen werden soll: Wir wollen die Kartoffel nachher durchschneiden, und die hierbei entstehenden Schnitthälften sollen sich gut so hinlegen lassen, dass die Schnittflächen nach ol)en sehen ; die Kartoffel muss also, wenn wir auf ihre gewöhnlich eUipsoide Gestalt die für die Erde gebräuchlichen Bezeichnungen anwenden, äquatorial durchschnitten, also an den Polen mit den Fingern angefasst werden. Die durchschnittene Kartoffel wird nun mit der linken Hand in die feuchte Kammer so gelegt, dass die beiden Schnitthälften von einander getrennt und die Schnittflächen nach oben gerichtet sind. Die feuchte Kammer besteht aus einem Paar geräumiger Griasschalen (Doppelschale), deren obere über die untere hinübergreift und als kappenartiger Deckel dient. Die untere hat c. 20 cm lichten Durchmesser und etwa 6 cm Höhe. Der Boden der inneren, unteren Schale ist mit einem kreisförmigen Stück Fliesspapier bedeckt, welches mit 7io P™^- Sublhnatlösung befeuchtet ist. Nach dem Einlegen der Kartoffeln wird die Deckelschale auf- gelegt; man lässt die Kartoffeln gründlich abkühlen und kann sie dann in der weiterhin zu besprechenden Weise impfen. Will man gekochte Kartoffeln zu Culturzwecken vorräthig (Mitth. a. d. Kais. Ges.-Anite. Bd. 1. 1881. p. 278) sehr bequem der Kupfer- Eeaction. Ein mit Schmirgelpapier blank geputztes Streif chen Kupferblech wird in die zu prüfende Lösung hineingebracht. Bildet sich innerhalb einer halben Stunde ein deutlicher Queksilberüberzug, so enthält die Lösung mindestens 1:5000 Subli- mat. Eine Vio procentige Lösung giebt die Eeaction schon innerhalb einer Minute deutiich. 134 A. ALgemeiues. halten , so kann man nach y. E s m a r c h i) so verfahren , dass man die rohen Kartoffeln schält, abspült, in Scheiben schneidet, nnd dass man diese Scheiben lq kleine gläserne Doppelschälchen (von 5 bis 6 cm Durchmesser) legt, die zuvor im Trockenschrank sterüisirt-) sind. Die so armirten Schälchen werden auf etwa "/^ Stunden in den Dampf- topf gestellt, dann herausgenommen und bis zur späteren Benutzung aufbewahrt. Andere Methoden bereiten die Kartoffel innerhalb des mit AVatte- pfi'opf verschlossenen Reagenzglases zur Cultur vor. Auf solchen Kartoffeln angelegte Culturen sind vor Verunreinigungen durch fremde Keime ganz sicher geschützt, während dies nicht von Kartoffelculturen gilt, die nach den zuerst besprochenen Methoden angestellt werden. Methoden der Kartoffelcultur im Reagenzglase haben Bolton"), Globig^), Roux'^) angegeben. Globig und Roux verwenden Kartoifelkeile, welche durch diagonale Durchschneidung von Kartoflfel- cy lindem hergestellt werden, die man mit dem Korkbohrer aus der Kartoffel aussticht. Gr lobig verwendet bereits gekochte, Roux rohe Kartoffeln. In beiden Fällen gelangen die Kartoffelkeile dann, mit dem breiten Ende voran, in ein Reagenzglas, welches durch einen Wattepfropf verschlossen wird. Da sich bei dem nachfolgenden Kochen resp. Sterihsiren Condensationswasser bildet, so lässt Roux die Kar- toffel auf einer in der Nähe des Bodens des Reagenzglases befind- lichen verengerten (eingezogenen) Stelle der Wand des Glases aufruhen, während H u e p p e '^) hierzu ein Stück Watte benutzt, welches auf den Boden des (in gewöhnlicher Weise geformten) Reagenzglases gebracht wird. Durch beide VoiTichtungen mrd die Berührung der Kartoffel mit dem Condensationswasser verhindert. Ich ') benutze zu diesem Zwecke kleine, kurze Glasröhrchen, auf denen der Kartoffelkeil semen Stützpunkt findet. Hat man bereits gekochte Kartoffeln für die ge- nannte Methode in Verwendung gebracht, so folgt nach dem Verschluss des Glases mit Watte die Sterilisii'ung, welche wie bei der Gelatine- etc. ') Centralbl f. Bakt. Bd. 1. 1S87. No. 1. ^) Diese vorherige Sterilisirung der Doppelschälchen im Trockenschrank ist nicht dringend nothwendig; es empfiehlt sich aber, falls man nicht steriiisirte Schälchen verwendet, die mit den Kartoffeln beschickten Schälchen an drei auf ein- anderfolgenden Tagen im Dampftopf zu erhitzen, und zwar am ersten Tage c. ' .3 Stunde, an den beiden folgenden Tagen je 15 Minuten. '0 Med. News. 1SS7. vol. 1. No. 12. *) Zeitschr. f. Hjg. Bd. 3. 1887. p. 298. '') Annales de l'Inst. Pasteur. 1888. No. 1. ®) Die Methoden der Bakterienforschung. 4. Aufl. 1SS9. p. 234. '') Deutsche med. Wochenschr. 1889. No. 20. V. Allgemeine Methodik der Bakterienzüchtung. 135 Bereitung vorgenommen wird. Hat man rohe Kartoffeln verwendet, so müssen die Kartoffelkeile erst gekocht, dann noch gründlich sterili- sirt werden. Zu dem Zwecke stellt man die Grläschen zunächst für 30 Minuten in den Dampftopf und wiederholt die Dampf behandlung an den beiden nächstfolgenden Tagen je 15 — 20 Minuten lang. — Bei der Verwendung von rohen Kartoffeln sieht man sehr häufig, dass die Oberfläche der Kartoffel während der Dampfbehandlung resp. Sterilisirung eine dunklere Farbe annimmt und zugleich erheblich trockener wii'd. Die Kartoffelfläche ist dann recht wenig zweckmässig für Bakterienculturen. Um diese Verfärbung und Eintrocknung zu vermeiden, empfiehlt es sich sehr, die zu benutzenden rohen Kartoffel- keile vor dem Einbringen in die Röhrchen zunächst sorgfältig in Wasser abzuspülen, und dann, nach dem Einbringen, noch einige Ti-opfen Wasser in jedes Röhrchen einlaufen zu lassen, die sich am Grunde des Röhrchens sammeln. Die Kartoffel hat gewöhnlich eine leicht saure Reaction. Für gewisse Zwecke ist es nothwendig, die Kartoffeloberfläche (z. B. durch 15 Minuten langes Einlegen in 1 proc. Sodalösung vor der Sterilisirung) schwach alkalisch zu machen. Eine Methode, frische Eier als Nährboden für Miki'oorganismen zu verwenden, hat Hueppe'-) angegeben: Die frischen Eier werden äusserlich sorgfältig (mit Hülfe von Seife, Wasser und Bürste) ge- remigt ; dann wird die Schale mit Sublimatlösung sterilisirt, mit steri- lisirtcm Wasser abgespült und mit steriler Watte abgetrocknet. Nun wird an der Spitze des Eies mit ausgeglühter Nadel eine feine Oeff- nung gemacht; durch die letztere hindurch wii'd mit Hülfe des Platin- drahtes die Infection des Eies bewirkt. Darauf bedeckt man die Oeff- nung mit einem kleinen Stück sterihsirten Seidenpapiers und befestigt das letztere mit Hülfe von Collodium fest an der Eischale, sodass die Oefihung luftdicht verschlossen wii'd.^) — Ich gehe behufs der Ei- ^) Dieses sehr zweckmässige Verfahren stammt von Herrn Scholz (Hygienisches Institut, Berlin). '-) Centralbl. f. Bakt. Bd. 4. 1888. No. 3. — Nach Hueppe 's Ansicht ist das Wachsthum der Bakterien innerhalb des Eies ein wesenthch anaerobes. Von vollständiger Anaerobiose kann aber sicher keine Rede sein, da der atmosphärische Sauerstoff durch die Schale in das Innere des Eies hineindiffundirt. Die im Ei aut- tretenden, das spontane Verderben der Eier bewirkenden Bakterienarten sind sammt mid sonders Aeroben (cf. Schrank, Wien. med. Jahrb. 1888. p. 320; Zörken- dörfer, Arch. f. Hyg. Bd. 16. 1893. p. 398; W. Hesse, Zeitschr. f. Hyg. Bd. 15. 1893. p. 25). ") Hammerl (Zeitschr. f. Hyg. Bd. 18. 1894. p. 155) sowie Sclavo (Della cultura del diplococco etc. Eoma. 1894) verschhessen das Ei sehr einfach mit einem Tropfen brennenden Siegellacks. 136 A. Allgemeines. inficirimg so vor, dass ich, nachdem das Ei an der Spitze mit Seife und Bürste gereinigt, mit gewöhnlichem Wasser (ohne Sublimat) ab- gespült und wieder getrocknet ist, das glühende Ende eines Kartoffel- messers oder Scalpells flach auf die Spitze des Eies auflege. Es ent- steht eine oberflächKch verkohlte, d. h. also sicher sterilisirte, Stelle, in welche mitten hinein mit geglühter und wieder erkalteter Is^adel unter drehenden Bewegungen ein Einstich gemacht wird, der sich leicht soviel erweitem lässt, dass der Platindraht oder die Platinöse eingeführt werden kami. Den Verschluss kann man dann entweder mit Collodium und sterilisirtem Papier oder, einfacher, mit brennendem Siegellack ') bewerkstelligen. Um die Ei Substanz für sich, von der Eischale entblösst, zu Culturzwecken zu verwenden, verfährt Zörkendörfer-) auf folgende Weise: Das frische Ei wird aufgeschlagen, und das Eiweiss mrd in der in der Küche üblichen Weise (nämlich indem man den Dotter mehrmals aus einer Schalenhälfte in die andere überfüllt) in ein (vor- her im Trockenschrank steriüsiites) Erlenmeyer'sches Kölbcheu eingefüllt. Dann wird der ganze Dotter auf die Mündung des Kölb- chens gelegt, und das letztere wird darauf in Eiswasser gestellt. Der Luftdruck presst nun den Dotter meist ohne Weiteres in das Kölb- ehen; event. hilft man durch Blasen etwas nach. Man hat dann das ganze Ei mit unverletztem Dotter hn Kölbchen: das letztere wird mit dem zugehörigen (sterilisirten) Wattepfi'opf verschlossen und dann zur sicheren Sterilisirung des Eies eine Reihe von Tagen je 1 — 2 Stunden einer Temperatur von 56 '^ C. ausgesetzt. Man verfährt also genau so wie bei der Sterihsirung des Blutserums (cf. oben p. 131). Ein wichtiger Nährboden für bakteriologische Zwecke ist die steri- lisirte Milch. Man füllt zur Herstellung dieses Nährbodens Reagenz- gläschen in der gewöhnlichen Weise zu etwa einem Drittel voll frischer, eben umgeschüttelter Milch, versieht sie mit Wattepfropfen und macht nun den Nährboden durch Erhitzen steril. Das Letztere ist aber keine leichte Aufgabe; unsere gewöhnlich zum Zwecke der Sterili- sirung von Nährböden im Laboratorium geübten Methoden versagen fast stets, wenn es sich um die Sterilisirung von ]\Iilch handelt. Es hat dies einfach darin seinen Grund, dass in der Mich, und zwar in jeder, auch der frischesten Milch, zahlreiche Keime von ganz ausser- ordentlicher Widerstandsfähigkeit vorhanden sind. Auf jeden Fall braucht man, wenn man nicht sehr hohe Temperaturen (im Auto- ^) cf. die vorige Anmerkung. ■2) Arch. f. Hyg. Bd. 16. 1S93. p. 3S0. V. Allt,'emeine Methodik der Bakterienzücbtung. 137 claveu; cf. p. 29) anwenden will, oder wenn man die Milch nicht ganz aussordentlich lange Zeit (eine grössere Eeihe von Stunden) im Dampftopf erhitzen will (wobei die Milch immer sehr erheblich ver- ändert wird), die discontinnirliche Sterihsirung. Es kommt aber da nicht allein darauf an, wie lange Zeit die Milch jedes einzelne Mal erhitzt wird, sondern auch darauf, bei welcher Temperatur sie in der Zwischenzeit zwischen den einzelnen Erhitzungen gehalten wird. Xach meinen Erfahrungen erhält man einen sicher sterilen Nährboden, wenn man die Milch an drei aufeinander folgenden Tagen je eine Stunde lang im Dampftopf hält und in der Zwischen- zeit jedesmal bei c. 21® C. stehen lässt. Die Milch nimmt bei dieser Methode der Sterilisirung eine ganz leicht hellbräunliche Färbung an. Eine besondere Stellung unter den für die Zwecke der Bakterien- cultur gebrauchten Nährböden nehmen diejenigen ein, welche eiw eiss- frei sind. Es hat damit folgende Bewandtniss: Bereits im Jahre 1858 zeigte P a s t e u r 1) bei seinen Untersuchungen über die Emährungs- bedingungen von Hefepilzen, dass diese Organismen zu ihrem Wachs- thum keine Eiweisskörper brauchen, sondern dass sie, me die grünen Pflanzen, den für den Auf bau ihres Leibes nothwendigen Stickstoff a u s A m m n i a k zu entnehmen vermögen. P a s t e u r benutzte bei seinen Versuchen eine eiweissfi-eie Nährflüssigkeit („Pasteur'sche Flüssigkeit"), auf welcher sich Hefepilze völlig normal entwickeln und vermehren können, und die besteht aus 100 Gew.-Th. destillirtem Wasser, 10 Th. reinstem Candiszucker, 1 Th. weinsaurem Ammoniak und der Asche von 1 Gew.-Th. Hefe (etwa 0,075 Gew.-Th.). Der Zucker diente in der Pasteur'schen Flüssigkeit den Hefepilzen als Kohlenstoffquelle, das weinsaure Ammoniak als Stickstoffquelle; ausser- dem waren zur Ernährung dieser Mkroorganismen noch ]\Iineral- substanzen nothwendig, welche durch die Hefenasche repräsentirt wurden. Die Pasteur'sche Flüssigkeit, welche, wie sich in der Folge zeigte, auch für Bakterien ein ausgezeichneter Nährboden ist, wm'de von A. Mayer'-) dahin modificii-t, dass anstatt der Hefenasche die in der- selben enthaltenen -wirksamen Salze zur Herstellung der Nährlösung genommen wurden. Im Anschlüsse an die Ermittelungen der vor- genannten Autoren construirte dann (1872) Ferd. Cohn'^) seine „normale Bakterien-Nährflüssigkeit", welche 1) Citirt nach F. Cohn, Beitr. z. Biol. d. Pfl. Bd. 1. Heft 2. 1872. p. 191 ff. '^) Untersuchungen über die alcoholische Gährung. 1870 (citirt nach F. Cohn. 1. c. p. 195). 3) F. Cohn, Beitr. z. Biol. d. Pfl. Bd. 1. Heft 2. 1872. p. 195, 196. 138 -^- Allgemeines. 0,1 g phosphorsaures Kali, 0,1 g cryst. schwefelsaure Magnesia, 0,01 g dreibasisch phosphorsauren Kalk auf 20 com dest. Wasser enthielt: in der Flüssigkeit wurde ferner aufgelöst 0,2 g weinsaures Ammoniak. In dieser Cohn" sehen Nährlösung ist das Ammoniak die Stick- stoff-, die Weinsäure die Kohlenstoffquelle der Bakterien. Aus weiteren Versuchen über die Ernährung der (von ihm untersuchten) Bakterien zog r. Cohn^) den Schluss, „dass die Bakterien in völlig normaler Weise und in grösster Ueppigkeit sich vermehren, sobald sie die er- forderlichen Aschenbestandtheile in Lösung vorfinden und ihren Stick- stoff aus Ammoniak oder Harnstoff, wahrscheinlich auch aus Salpeter- säure, ihre Kohle aus irgend einer organischen Kohlenstoff\-erbindung, entnehmen können". Der Vergleich eiweissfreier und eiweisshaltiger Nährböden führte Cohn-) zu dem Ergebniss, dass mit grosser Wahr- scheinlichkeit die Assimilationsprocesse bei den Bakterien die nämKchen seien, möge ihnen der Stickstoff in Form von Ammoniak oder in Form von Eiweisskörpem geboten werden. Einen weiteren Fortschritt in der Kenntniss der Ernährungsverhältnisse der Mikroorganismen verdanken wir dann C. v. Nägeli,'^) welcher ermittelte, dass der Stickstoff aus seinen Verbindungen am leichtesten assimilirt wird, wenn er als NH., vorhanden ist, weniger leicht, wenn als NH, noch weniger leicht, wenn als NO vorhanden. Ueberblickt man die vorstehend referirten Ermittelungen, so er- scheint es nicht auffällig, dass es kürzlich U s c h i n s k y ■*) gelungen ist, einen ei w eissfreien Nährboden herzustellen, auf dem eine grosse Reihe von pathogenen Bakterienarten gut gedeihen. Die „Uschinskj- sche Lösung" besteht aus Wasser 1000 Mag-nesiimisulfat 0,2—0,4 Gljcerin 30—40 Dikaliumphosphat 2—2,5 Chlomatrium 5 — 7 Ammonium lacticum 6 — 7 Chlorcalcium 0,1 Natrium asparaginicum '') 3,4. ^) 1. c. p. 202. '-) 1. c. p. 210. ■') C. V. Nägel i. Untersuchungen über niedere Pilze. München und Leipzig. 1882. p. 5. *) Centralbl. f. Bakt. Bd. 14. 181)3. p. 316. ^) Ueber die Verwendbarkeit des Asparagins zur Ernährung von Spaltpilzen siehe C. v. Nägeli, 1. c. (1882) p. 29 etc. V. Allgemeine Methodik der Bakterienzüchtung. 139 C. FränkeP) hat die „TTscliinsky 'sehe Lösung" in folgender Weise vereinfacht: Er nimmt Kochsalz 5 g Kaliimibiphosphat 2 g Ammonium lacticum 6 g käufl. Asparagin 4 g Wasser 1000 g und setzt dazu verdünnte Natronlauge bis zu deutlich alkalischer Reaction. Auch auf dieser Lösung Avachsen, wie C. Fränkel festgestellt hat, eine gTOsse Reihe von saprophytischen sowohl wie von pathogenen Bakterienarten. -) Die genannten eiweissfreien Nährlösungen werden ebenso steri- lisirt, wie es bei der Gelatine, dem Agar etc. geschieht, d. h. sie werden, in mit Wattepfropf versehenen Gelassen eingeschlossen, an drei aufeinander folgenden Tagen je 15 bis 20 IVIinuten im Dampftopf gehalten. Zur Züchtung von Schimmelpilzen benutzt man mit Yortheil Brotbrei. Um denselben herzustellen, füllt man getrocknetes und zerriebenes Brot in Reagenzgläser bis etwa zur Höhe von 3 bis 4 cm (oder noch besser in Erlenmeyer'sche Kölbchen, etwa 1 cm hoch) ein. Man giebt dann so viel Wasser hinzu, dass das Brot völlig durchfeuchtet wird, verschliesst das Röhrchen resp. Kölbchen mit einem Wattepfropf und erhitzt nun behufs der Sterilisation an drei auf einander folgenden Tagen je 15 bis 20 Minuten im Dampftopf. Der Brotbrei reagirt sauer, ist also für Bakterien kein passender Nährboden. 3. Die wichtigsten Methoden der Bakteriencultur. Zur Isolirung der einzelnen Arten aus einem Bakteriengeniische bedient man sich jetzt fast ausschliesslich der Koch" sehen Platten- culturmethode.'^) Diese Methode setzt einen gelatinirenden Nähr- 1) Hyg. Rundschau. 1S94. p. 772. ■-) Kein Wachsthum zeigte auf diesem Nährboden unter Anderem der Tu- berkelbacillus (vergl. hinten das dem Tuberkelbacillus gewidmete Kapitel); da- gegen wuchs dieser Mikroorganismus rasch und üppig, sobald der obigen Nährlösung .3 — 4^/o Glycerin zugesetzt wurden. ^) Das Princip dieser Methode hat Koch zuerst angegeben in den Mitth. aus d. Kais. Ges.-Amte. Bd. 1. 18S1. p. 27. Zeüe 25—29 und p. 36. Zeile U — 14. 140 A. Allgemeines. boden voraus, der ini flüssigen Zustande mit dem Bakterieimiaterial so beschickt wird, dass sich die einzelnen Keime möglichst gleichmässig in ihm vertheilen, der dann auf einer möglichst grossen Fläche aus- gebreitet und dort zur Erstarrung gebracht wii'd. Dann sind die em- gesäeten Keime örtlich fixirt und kommen zu isolii'ter Entwickelung. Als Nährboden kommt meist die gewöhnliche Xährgelatine (cf. oben p. 119) zur Verwendung. Nach der ursprünglichen Koch* sehen Vor- schrift verfährt man hierbei folgendermassen : Es wird ein Eeagenzglas, welches c. 1 ccm sterilisirte Kährgelatine enthält („Gelatineröhrchen") , genommen und sein unterer Theil über der Flamme (oder in c. 40^ C. warmem Wasser) leicht erwärmt, so dass die Gelatine schmilzt. Ist bei der Erwärmung über der Flamme die Gelatine zu heiss geworden, so muss sie bis etwa zur Handwärme wieder abgekühlt werden. Xun wird das Gläschen in die rechte Hand genommen, der verschliessende Wattepfropf wird mit den Fingern der hnken Hand erfasst, dm'ch Drehen zunächst gelockert und dann herausgezogen. Dann bring! man das schräg gehaltene Köhrchen mit seiner Mündung mehrere Secunden lang in die Bunsenflamme, indem man es dm'ch Bewegen mit den Fingern mn seine Längsachse rotiren lässt. Dabei wird der E a n d des Gläschens „abgeglüht", die dort befindlichen, aus der Luft zufällig aufgefallenen Keime werden ,.abgebrannt". (IVir müssen dies thun einerseits, um zu vermeiden, dass bei dem nachfolgenden Lnpfen des Eöhrchens von den genannten fremden Keimen etwas mit in das Eöhrchen hinein gelangt, anderer- seits auch, um zu vermeiden, dass, bei dem weiterhin folgenden Aus- giessen der geimpften Gelatine auf die Culturplatte, diese fremden Keime mit auf die Platte hinübergerissen werden.) Dann wii'd das Gläschen so zwischen Daumen und Zeigefinger der mit dem Hand- teller nach oben gerichteten ausgestreckten linken Hand gesteckt, dass seine Mündung nach oben sieht. Der Wattepfropf ^vird z-oischen den zweiten und dritten Finger der linken Hand so geklenmit, dass der im Glase befindlich gewesene Theil des Pfropfes von den Fingern nicht berührt wird. Xun wird die Gelatine „inficirt". Das luficiren geschieht mit Hülfe eines Platindrahtes, welcher etwa 6 — 7 cm lang, nicht zu dünn, und an einem etwa 20 cm langen Glasstabe angeschmolzen ist. Von derartigen Platindrähten hält man sich mehrere vorräthig. Einzelne sind geradlinig gestreckt; bei anderen ist das Ende zu einer etwa 2 mm im Durchmesser haltenden ki'eisförmigen Oese gebogen („Platin Öse"). Je nachdem man nun ein Material vor sich hat, welches ausserordentlich reich au Bakterien ist (wie z. B. die Kahm- V. Allgemeine Methodik der Bakterienzüchtung. - 141 haut auf der Oberfläche eines faulenden Pflanzenmfuses), oder welches weniger reich an Bakterienkeimen ist (wie z. B. käufliche rohe Mich), nimmt man entweder mit der Spitze oder mit der Oese etwas von dem zu untersuchenden Material und bringt es in die Gelatine. An der Spitze nämlich bleiben stets erheblich geringere Quantitäten des Materials haften als an der Oese. Bevor man die Platindrähte be- nutzt, werden sie in dem Flammenmantel des Bunsenbrenners oder in der Spiritusflamme ausgeglüht, dann wieder erkalten gelassen. Der inficirte Platindraht resp. die Platinöse werden in das Gelatineröhrchen so eingeführt, dass man eine Berührung der Wand des Gläschens mit dem Bakterienmateriale oberhalb der Gelatine möglichst vermeidet. Das ganze Material soll in die Gelatine gelangen und nicht etwa zu einem grösseren oder geringeren Theile am Glase hängen bleiben. Das Material wird dann durch Agitiren mit dem Platindrahte möglichst gleichmässig in der Gelatine vertheilt. Hat man consistenteres Material vor sich, welches sich nicht so leicht gleichmässig vertheilen lässt, so empfiehlt es sich, dasselbe dicht oberhalb der Gelatine an der Glas- wand unter Zuhülfenahme kleiner Mengen Gelatine mit Hülfe des Platindrahtes zu zerreiben und dann durch Bewegen des Röhrchens in die Gelatine hineinzuspülen. Auf jeden Fall kommt es also immer darauf an, das zu unter- suchende Material in möglichst vertheiltem Zustande mit der Nährgelatine zu vermischen. Es giebt Fälle, in denen die hierzu nothwendige Zertheilung und Zerkleinerung des Materials auf dem geschilderten Wege nicht gelingt. Wenn wir z. B. ein Stückchen einer frischen Fawsborke mit Hülfe des Platindrahtes in die geschmolzene Nährgelatine eintragen würden, so würde uns die nothwendige Zer- kleinerung dieses Materials durch Agitiren etc. in keiner Weise ge- lingen, r In solchen Fällen habe ich mir auf folgende Weise geholfen : Ich improvisirte mir eine sterilisirte Reibschale und ein steri- lisirtes Pistill: erstere, indem ich ein reingeputztes Uhrschälchen über der Flamme stark erhitzte und dann erkalten liess; letzteres, in- dem ich ein leeres, trockenes, reingeputztes Reagenzglas an seinem geschlossenen Ende in der Flamme stark erhitzte und dann erkalten hess. Dann wurde etwas sterile Bouillon m das sterile Uhrschälchen gegossen, das zu zerkleinemde Material (Favusborke etc.) hineingegeben und mit Hülfe des „Reagenzglaspistills" fein zerrieben. Hat man sich derartiges, mehr oder weniger zähe zusammenhängendes, Material auf die geschilderte Weise zertheilt und zerkleinert, so nimmt man dann eine Platinöse voll der das zerkleinerte Material ent- haltenden Bouillon heraus, trägt die Oese in die geschmolzene Gelatine, 142 A.. Allgemeines. die zui- Plattencultur verwendet werden soll, ein, und es ist dann ein Leichtes, das Material gieichmässig in der Gelatine zu vertheilen."^ Wir haben nun eine Portion Gelatine inficirt, wir haben das Keimgemisch, welches wir untersuchen wollen, möglichst sorgfältig in der Gelatine zer- und vertheilt, so dass die einzelnen Zellen möglichst von einander entfernt liegen. Wir könnten nun, ^\ie das nachher auch geschehen soll, die inficirte Gelatine auf eine sterile Glasplatte in möglichst dünner Schicht ausgiessen, und wir -würden dann nach der Erstarrung der Gelatine, d. h. also nach der örtlichen Fimamg der einzelnen Keime, aus diesen einzelnen Keimen isolirte Colonien ent- stehen sehen. Nun aber bringt es die Kleinheit der Bakterien mit sich, dass auch die kleinste Menge des Bakteriengemisches, die wir mit Hülfe des Platindrahtes in die Gelatine übertragen, gewöhnlich noch Tausende und aber Tausende von Zellen enthält. Es würden auf unserer Platte also ebenso viele Colonien zur Entwickelung gelangen, und diese würden dann so dicht gedrängt liegen müssen, dass kaum von einer isolh'ten Beobachtung derselben die Eede sein könnte, ge- schweige denn von einer weiteren Manipulation mit den einzelnen Colonien. Aus diesem Grunde begnügt man sich nie mit dem einen inficirten Glase, sondern man macht ohne Weiteres von diesem Glase „Verdünnungen". Zu dem Zwecke bringt man ursprünglich (cf. p. 140) nicht nur in einem, sondern gleich in drei Gelatine- röhrchen die Gelatine zum Schmelzen. Ist das erste Köhrchen („Original") mit der Bakterienmasse inficirt, so nimmt man sofort ein zweites, noch steriles Röhrchen, entfernt seinen Wattepfropf, glüht seinen Rand ab (cf. p. 140) und stellt es neben das erste Röhrchen, also ebenfalls zwischen Daumen und Zeigefinger der linken Hand. Den Wattepfi"opf klemmt man nun zwischen dritten und vierten Finger der linken Hand. Man überträgt dann eine Anzahl Platinösen (ge- wöhnlich drei) der inficirten Gelatine des Originalgiases in das zweite Glas („Erste Verdünnung"). Nach gehöriger Vertheilung dieser drei Oesen in der Gelatine des zweiten Gläschens (die Ver- theilung erleichtert man event. durch Hin- und Hemeigen des Gläschens) wird das Originalglas mit dem zugehörigen Wattepfropf verschlossen, beiseite gestellt, und es werden dann aus dem zweiten Gläschen wiederum drei Oesen Gelatine in das dritte, noch sterile Gläschen übertragen („Zweite Verdünnung"). Vorher bereits hat man sich die drei Platten, auf die man die Gelatine der drei Gläschen ausgiessen will, zurecht gelegt. Die Platten sind von nicht zu dickem Glase, rechteckig und messen etwa 8:13 cm. Sie müssen sorgfältig sterilisirt sein, ehe sie zur Benutzung kommen. V. Allgemeine Methodik der Balvterienzücbtung. 143 Das S t e r i 1 i s i r e n bewirkt man am besten in dem Trocken- schrank (cf. p. 27). Die Platten werden zu dem Zwecke, rein ge- putzt und getrocknet, in grösserer Anzahl auf einander gelegt und in eine Tasche von starkem Eisenblech, die mit übergreifendem Deckel versehen ist („P lattentasch e") geschoben. Diese Tasche wird dann während etwa ^j^ Stunden in dem Trockenschranke einer Temperatur von 160 C. oder darüber ausgesetzt. Nach dem Abkühlen^) werden drei von den Platten, die man aber nur an den Kanten berühren darf, aus der Tasche herausgenommen und nun über einander auf eine horizontal eingestellte Platte von starkem Glase gelegt, welche die Bedeckimg einer mit AVasser und Eisstücken voll angefüllten Glasschale bildet (Koch 's Gies sapparat). Das Eis- wasser kühlt die Glasplatten ab. -) lieber die Platten wird eine Glas- glocke gestülpt, welche das Auffliegen von Luftkeimen auf die Platten verhindert. Verfügt man über einen Trockenschrank nicht, so kann man die Platten auch sehr bequem dadurch sterilisiren, dass man sie, indem man sie mit den Fingern an den Kanten festhält, beiderseits in der Gas- oder Spiritus flamme stark erhitzt. Man lässt sie dann unter einer Glasglocke abkühlen. Wir gehen jetzt daran, unsere drei inficii'ten Gelatineröhrchen auf die zurechtgelegten, durch Eis abgekühlten Platten auszugiessen. Zu dem Zwecke nehmen wir zunächst das „Original"- Röhrchen in die rechte Hand, entfernen den Wattepft'opf, den wir sofort in eine Schale mit Desinfectionsflüssigkeit'^) werfen, und glühen (wie oben, p. 140, beschrieben) den Rand der Mündung des Röhrchens von Xeuem in der Flamme ab. Nachdem der Rand des Gläschens wieder ab- gekühlt ist, wird der über die Platten gestülpte Deckel (die Glas- glocke) des Giessapparates mit der linken Hand in die Höhe gehoben, und es wird nun die inficirte Gelatine des Originalglases in einem Zuge auf die Mitte der obersten Platte ausgegossen. Unmittelbar darauf sorgt man für möglichste Flächenausbreitung der Gelatine da- durch, dass man dieselbe mit dem Rand des Röhrchens direct auf der ^) Das Abkühlen muss sehr langsam, am besten innerhalb des nach Ab- stellung der Heizung erkaltenden Trockenschrankes, geschehen, weil sonst die Platten gewöhnlich entzwei springen. -) ßubner (Arch. f. Hyg. Bd. 11. 1890. p. 367) legt die Platten behufs der Abkühlung auf einen Kupferblechkasten, dessen horizontal gestellte obere Wand von unten her durch einen Aetherspray abgekühlt wird. •^) Hierzu eignet sich besonders gut eine etwa Sprocentige wässerige Lösung der oben (p. 33) angegebenen rohen Schwefelcarbolsäure; auch die bereits (p. 132) genannte Salzsäuresublimatlösung lässt sich verwenden. 144 A. Allgemeines. Platte ausstreicht und vertheilt. Die Gelatine soll hierbei überall etwa 1 cm vom Rande der Platte entfernt bleiben; denn den Eand resp. die Kanten der Platte haben ^v^: mit den Fingern berührt und werden wir weiterhin noch berühren. Diese Theile sind also nicht als steril zu betrachten ; sie würden uns fi*emde Keime auf unsere Platte bringen. Nun wird der Deckel -wieder auf den Giessapparat aufgesetzt; das seiner Gelatine entledigte Röhrchen kommt in die Desinfectionsfiüssig- keit (s. oben). Innerhalb des Bruchtheils einer Minute ist dann die Gelatine erstarrt. Die Platte wird nun nach Lüftung des Deckels, indem man sie an den Kanten erfasst, von den darunter liegenden Platten abgehoben und in querer Lage auf ein etwa 5^.^ cm breites, 14 cm langes Glasbänkchen gelegt, welches aus einer Glasplatte von den angegebenen Dimensionen und zwei imter die Enden derselben mit Siegellack festgekitteten vierkantigen Glasklötzchen (von etwa 51/2 cm Lcänge, 1 cm Breite, 7 mm Höhe) hergestellt ist. Zwischen Glas- bänkchen und Platte legt man einen Papierzettel, welcher die genaue Bezeichnung des Platteninhaltes und das Datum enthält. Man hat sich gewöhnt, die Originalplatte mit „0", die erste Verdünnung mit „I", die zweite mit „IE" zu bezeichnen. Das Bänkchen wird dann mit der Platte in die feuchte Kammer gestellt, die man sich ebenso herstellt, wie wii* es oben (j). 133) für die nach der ui'sprünglichen Koch" sehen Methode hergestellten Kartoffelculturen angegeben haben. Nun wird das zweite Röhrchen, die erste Yerdünnung, auf die zweite auf dem Giessapparate liegende Platte, in derselben Weise me vorher das Originalröhrchen , ausgegossen, dann nach dem Erstarren der Gelatine die Platte auf ein bezeichnetes Bänkchen gelegi und das letztere auf das Bänkchen der Originalplatte in die feuchte Kammer gestellt. In derselben Weise wird auch das dritte Röhrchen behandelt, und das dritte Bänkchen schliesslich auf das zweite Bänk- chen in die feuchte Kammer gestellt. Die letztere bleibt nun bei Zimmertemperatur stehen. Am günstigsten ist im Allgemeinen für die Gelatineculturen eine Temperatur von 18 — 20 ^ C. Haben die Plattenculturen 24 Stunden bei den angegebenen Temperaturen gestanden, so zeigt die Originalplatte gewöhnlich schon bei der Betrachtung mit blossem Auge eine mehr oder weniger auf- fallende Träbung; und bei schwacher Yergrösserung sieht man dann gewöhnlich äusserst zahlreiche, sehr kleine, mehr oder weniger rund- liche, dichtstehende dunkle Flecken, von denen jeder eine Colonie repräsentirt, die aus einem einzelnen Keime hervorgegangen ist. An den Verdünnungsplatten sieht man zu dieser Zeit gewöhnlich m a k r - V. Allgemeine Methodik der Bakterienzüchtung. 145 s k p i s c h noch nichts ; aber in den nächsten Tagen, wenn das Wachs- thrnn mehr vorgeschritten ist, kommen hier die isohrten Colonien schon makroskopisch zur Geltung. Man sieht dann oft ohne Weiteres schon mit blossem Auge, dass man es nicht mit einer einzigen Bakterien- art zu thun hat, sondern dass auf der Platte verschiedenartige Keime zur Entwickekmg gelangt sind. Denn ein ceteris paribus verschieden- artiges Aussehen der Colonie berechtigt natürlich ohne Weiteres zu dem Schlüsse, dass es sich um verschiedene Arten handelt. Wir sehen hier z. B. eine Colonie, die als weisses Häufchen erscheint, welches auf der Gelatineoberfläche aufsitzt; eine andere Colonie characterisirt sich als ein mehr flächenhaft ausgebreitetes irisirendes Häutchen, welches die Oberfläche der Gelatine überzogen hat. Dann fällt uns eine andere Colonie durch ihre lebhafte (z. B. gelbe oder rosa) Färbung auf. Alle diese Colonien haben die umgebende Gelatine intact gelassen. Andere haben die Gelatine an der Stelle ihres Wachsthums verflüssigt; bei der einen Colonie ist diese Verflüssigung stärker, bei der anderen weniger stark ausgesprochen. So finden wir schon makroskopisch hier und da Unterschiede der verschiedenartigen Organismen, welche zur Entwickelung auf der Platte gelangt sind. Wir werden uns aber nicht begnügen, die Untersuchung maki'oskopisch vorzunehmen; wir legen vielmehr unsere Platte auf den Objecttisch des Mikroskopes und mustern sie mit schwachem System. Nach den oben (p. 56 ff.) gegebenen Auseinandersetzungen über die mikro- skopische Beleuchtung werden wir hierbei den Abbe' sehen Apparat durch enge Blende abblenden müssen. ^) Bei der mikroskopischen Betrachtung der Platte kommen nun morphologische Eigenschaften der Colonien zu miserer Kenntniss, von denen wir vorher nichts gesehen haben. Zunächst ist ein all- gemeiner Unterschied zwischen solchen Colonien zu machen, welche innerhalb der Gelatine liegen, und solchen, die sich an der Oberfläche befinden oder bei ihrem Wachsthum die Oberfläche er- reicht haben. Während die ersteren sich meist als mehr oder weniger rundliche Gebilde darstellen, zeigen die letzteren eine viel grössere Mannichfaltigkeit iu ihrer Gestalt. ') Abgesehen von der verschiedenen ^) Während wir bekannthch (cf. oben j). 57) bei Benutzung des Abbe'schen Condensors im AJlgemeineu stets den Planspiegel anwenden, ist es für schwache Vergrösserungeu (also auch für den vorliegenden Fall) , speciell bei Verwendung von Lampenhcht, angängig, den Hohlspiegel zu gebrauchen (cf. p. 57, Anm. 3). -) Es ist an dieser Stelle darauf aufmerksam zu machen, dass unter den Colonien, welche einer und derselben Bakterienart angehören, mitunter ganz ausserordentliche Unterschiede in dem Aussehen sich bemerkhch machen, je Günther, Bakteriologie. 4. Auflage. 10 146 A. AUgemeiües. räumlichen Ausdehnimg sehen wir z. B. characteristische Unterschiede der Colonien in der Gestaltung des Bandes. Die einen haben einen ganz glatten, die anderen einen mehr buckeligen, unregelmässig ge- kerbten Rand. Andere zeigen eine deutlich lockenförmige Gestaltimg des Randes, gebildet von in zierlichen Windungen neben einander her- laufenden Zügen von Bacillenfäden ; andere senden weite, fadenförmige Ausläufer aus ; bei anderen erscheint der Rand der kreisrunden Colonie wie mit feinsten Stacheln besetzt. Und wie in der Gestaltung des Randes, so zeigen die Colonien auch in ihrem Inhalte erhebliche Differenzen unter einander. Die einen zeigen ein grobkörniges, andere ein feinkörniges, fast homogenes Gefüge. So giebt es die mannich- fachsten Unterschiede in der Gestaltung und dem Aussehen, und jeder Unterschied deutet sofort auf eine Verschiedenartigkeit der Keime, aus denen die Colonien entstanden sind. Das Letztere gilt, wie bereits oben (p. 145) angedeutet, selbstverständlich nur für den Fall, dass die Be- dingungen, unter denen die mit einander in Vergleich gezogenen Colonien sich entwickelt haben, genau die gleichen waren. Unter differenten äusseren Bedingungen lassen Keime derselben Art ge- wöhnlich different erscheinende Colonien entstehen. IS^amentlich kommen hier Temperaturverhältoisse in Frage. Je höher die Temperatur ist, bei der die Culturplatte steht, desto geringer ist die Consistenz der Gelatine, desto leichter kommen — namentlich bei beweglichen Bakterien- arten und bei solchen Ai'ten, die die Gelatine verflüssigen — Variationen in der Gestaltung der Colonien, namenthch was den Rand betrifft (Anhängsel, Ausläufer etc.), zu Stande. Auf eine von mir beobachtete, allerdings nicht allzu häufige, Er- scheinung möchte ich an dieser Stelle, quasi in Parenthese, auf- merksam machen: Man sieht nämlich gelegentlich bei der Betrach- tung einer CultuiiDlatte mit schwacher Vergrösserung — und zwar betrifft diese Erscheinimg nur solche Platten, die nicht allzu dicht besäet sind — , dass die einzelnen, relativ grossen Colonien von je einem ganzen Heer kleiner Colonien umgeben sind. Man constatirt bei der Dm-chmusterung solcher Platten ganz deuthch, dass jeder Haufen kleiner Colonien zu einer ganz bestimmten grossen Colonie gehört; eme Verbindung der grossen Colonie mit den dazu nachdem die Colonien in der Tiefe der Gelatine oder an ihrer Ober- fläche liegen. So erscheinen z. B. die tief hegenden Colonien des Bact. coli unter allen Umständen als kleine, über Stecknadelknopfgrösse kaum hinausgehende, rund- liche Gebilde, während die oberflächlichen Colonien derselben Art häutige üeberzüge auf der Gelatine darstellen, die häufig eine nach Centimetem zu bemessende Aus- dehnung erreichen. V. Allgemeine Methodik der Bakterienzüchtung. 147 gehörigen kleinen oder der kleinen Colonien unter einander ist im Uebrigen nicht zu erblicken. Diese Erscheinung, welche nur bei be- weglichen Bakterienarten vorkommt, hat man sich folgendermassen zu erklären: Auf der Platte haben sich zunächst von einander isolirte Colonien bis zu einer bestimmten Grössenausdehnung entwickelt. Dann ist die Platte vorübergehend (z. B. dadurch, dass sie an einen Ort gestellt worden war, auf welchen vorübergehend Sonnenschein triflft) zu warm geworden; die Gelatine ist dadurch zeitweilig weicher oder selbst halbfiüssig geworden. Während dieser Zeit haben eine Anzahl der die einzelne Colonie zusammensetzenden beweglichen Bakterien- zellen Gelegenheit gefunden, von der Colonie weg in die Umgebung auszuschwärmen. Dann hat sich die Platte wieder auf die normale niedere Temperatur abgekühlt, und dadurch sind die ausgeschwärmten Zellen an Ort und Stelle, in der Umgebung der Colonie, festgehalten worden. Aus jeder derartigen Zelle ist dann eine secundäre Colonie entstanden; und diese secundären Colonien imigeben dann in ihrer Gesammtheit die ursprüngliche, primäre Colonie. Wenden wir uns jetzt der Betrachtung der Culturplatte im All- gemeinen wieder zu, so ist bezüglich des Aussehens der Colonien noch Folgendes hervorzuheben: Stellt man bei der Besichtigung der Platte mit schwachem Mkroskopsystem eine bestimmte Colonie ein, so macht man ganz regelmässig die Beobachtung, dass die Colonie ein verschiedenes Aussehen darbietet, je nachdem die Einstellung eine „hohe" oder eine „tiefe" ist. Da nämlich die Bakteriencolonie ein relativ dickes Gebilde ist, so ist es nicht möglich, sie gleichzeitig in allen einzelnen Theilen scharf einzustellen. Eine innerhalb der Gelatine liegende Colonie wird in ihrer äusseren Begrenzung natur- gemäss bei einer mittleren Einstellung am schärfsten erscheinen. Ver- ändert man nun die Einstellung, geht man aus der mittleren Stellung mit dem Tubus mehr nach oben oder mehr nach unten, so beobachtet man nicht nur eine Abnahme der Schärfe der äusseren Begrenzung der Colonie, sondern man sieht, dass auch die Helligkeitsverhältnisse der inneren Theile der Colonie sich verändern. Colonien, welche innerhalb der Gelatine liegen, zeigen bei hoher Einstellung ein hell- glänzendes Innere; bei tiefer Einstellung erscheint das Innere dunkel. Es hat das einfach darin seinen Grund, dass die die Colonie zusammen- setzende Bakterienmasse ein höheres Lichtbrechungsvermögen besitzt als die umgebende Gelatine, und dass deshalb die rundliche Colonie wie eine kleine Convex linse wirkt. Es giebt aber auch Colonien, die wie Concavlinsen wirken, und die dementsprechend bei tiefer Einstellung glänzen und bei hoher dunkel erscheinen; das sind aus- 10* 148 -^- Allgemeines. nahm sl OS verflüssigende Colonien, die an der Ober- fläche der Gelatine sitzen. Wo nämlich an der Oberfläche der Gela- tineplatte eine verflüssigende Colonie sich entwickelt, da kommt es stets zu emem sichtbaren Defect des Nährbodens, zm' Bildung ebier Emsenkung, einer Delle, und zwar einfach aus dem Grunde, weil die verflüssigte Gelatine mehr Wasser durch Verdunstung abgiebt als die benachbarte fest gebhebene Gelatine. Mit der Ausbildung einer solchen oberflächüchen Einsenkung ist aber ohne Weiteres die Concavlinse fertig gestellt. Betrachten wir die in unseren Tafeln dargestellten Plattencolonien, so zeigt zunächst Fig. 25 auf Taf. V eine Stelle aus einer Platten- cultm", welche mit Heustaub angelegt ^vurde, nach zweitägigem Wachs- thum, bei 25facher Vergrösserimg. Wir sehen da hnks oben mehrere kleinere Colonien, die als dunkle Flecken erscheinen; mehr nach rechts hinüber liegen mehrere grössere Colonien von ähnlichem Aussehen, die sich z. Th. decken; alle diese Colonien gehören wahrscheinlich Bak- terien an. Dazmschen aber sehen wir zwei Schiimneipilzcolonien ihre zarten Mycelien aussenden. AVii- sehen diesen Colonien es ohne Weiteres an, dass sie nicht Bakterien, sondern Fadenpilzen angehören; denn mr können hier bei 25facher Vergrösserung (das Pbotogramm wird man zweckmässig mit der Loupe betrachten) bereits die beiden Contouren der überall gleich starken Mycelfäden deutlich unterscheiden. Diese Gebilde sind '\'iel dicker, als ein einzelner Bacillen- faden es sein würde; und, zögen mehrere oder viele Bacillenfäden neben einander her, die in ihrer Gesanmitdicke einem solchen Pilzmycelfaden entsprechen würden, so würden wir an einzelnen Stellen dünnere, an anderen Stellen dickere Gebilde (je nach der Menge der zusammen- liegenden Bacillenfäden verschieden) sehen müssen. Die doppelt- contourirten, überall gleich starken Fäden, welche wir bereits bei so schwachen Vergrösserungen deutlich sehen, lassen stets mit Bestimmtheit auf Fadenpilze schhessen. Plattenculturen bei schwacher Vergrösserung zeigen femer Fig. 31, Taf. VI (Milzbrandbacillus), Fig. 49, Taf. ES (Tyi)husbacillus), sowie Fig. 61 und 62, Taf. XI ( Cholerabacillus). Die erste ist bei 43facher, die anderen sind bei lOOtächer Vergrösserung dargestellt. Man sieht das fundamental verschiedenartige Wachsthum dieser Organismen in der Plattencolonie. Auf Taf. IV, Fig. 24, ist eine Plattencolonie der von mir öfters im Berliner Leitungswasser gefimdenen (cf. p. 19) Cladothrix bei lOOfacher Vergrösserimg abgebüdet. Will man eine Colonie bei stärkerer Vergrösserimg (mit starkem Trockensystem oder mit der Inunersion) dii-ect untersuchen, so muss V. Allgemeine Methodik der Bakterienzüchtung. 149 man auf die Platte ein Deckglas auflegen und die Platte nun wie ein gewölinliches mikroskopisches Präparat behandeln. Auf die spätere weitere Benutzung der Colonie zur Entnahme von Material hehufs der Weiterzüchtung etc. muss man dann allerdings verzichten. Auf Taf XII, Fig. 72, ist ein auf diese Weise mit starkem Trockensystem gewonnenes Bild dargestellt. Ist das Wachsthum der Plattencultur noch nicht zu weit vor- geschritten, so gelingt es meist, sich recht schöne Situ sbil der der oberflächlichen Colonien dauernd zu fixiren in Form der sogenannten Klatschpräparate (Contactpräparate).^) Verflüssigende Arten eignen sich hierzu allerdings nur so lange, als die Verflüssigimg noch nicht augenfällig geworden ist, so lange die Gelatine in dem Bereiche der Colonie noch nicht eigentlich verflüssigt ist, höchstens etwas weicher zu werden beginnt. Ueberhaupt eignen sich junge Colonien besser als alte für diese Präparation. Um sich ein solches Klatsch- präparat darzustellen, legt man ein rein geputztes Deckglas mit der Pincette auf die Platte auf, lässt es einen Augenblick los und nimmt es dann mit Hülfe der Pincette von der Gelatiaeoberfläche wieder herunter. Man hat dann einen Abklatsch der oberflächlichen Colonien auf dem Deckglase. Nachdem man ein solches Präparat recht sorgfältig hat lufttrocken werden lassen, fixirt man es in ge- wohnter Weise in der Flamme, färbt es wie ein gewöhnliches Trocken- präparat und schliesst es in Balsam ein. Man bekommt so nicht allein dauernde Bilder von der Lagerung der Organismen zu einander innerhalb der Colonie, man erhält so überhaupt die klarsten, distinctesten Bilder der einzelnen Bak- terienzellen. Die diesem Buche beigegebenen Photogramme sind zimi Theil nach solchen „Klatschpräparaten" hergestellt. Speciell will ich auf Fig. 33 (Taf. VI) aufmerksam machen. Hier haben wir ein Klatschpräparat von Milzbrandbacillenfäden bei lOOOfacher Vergrösse- rimg. Das Präparat stellt den Abklatsch einer Plattencultur dar, welche in Fig. 32 bei 40 facher Vergrösserung abgebildet ist. (Diese Plattencultur ist nach Strichimpfting des Bacillenmaterials auf sterile, auf die Platte ausgegossene und dann erstarrte Gelatine [cf unten p. 160] entstanden). Die feinen Locken der Cultur Fig. 32 lösen sich in Fig. 33 in die deutlich gegliederten Bacillenfäden auf Kehren wir nun zu unserer Plattencultur, in welcher sich aus den in der Gelatine vertheilten Keimen einzelne, isohi-t liegende Colo- nien entwickelt haben, zurück. Würden wü- dieselbe sich selbst über- ^) cf. R. Koch. Mitth. a. d. Kais. Ges.-Amte. Bd. 2. 1884. p. 5-1. 150 -^- Allgemeines. lassen, so würden niit weiterschreitendem Waclisthum die Colonien allmählich mit ihren Grenzen an nnd in einander gerathen, und dann wäre es mit der Isolirung der Colonien vorbei. So sehen wir denn auch auf den Originalplatten, wo die Colonien gewöhnlich äusserst dicht gedrängt liegen, derartige Zustände in der Kegel eintreten. Eine solche Platte bietet nach wenigen Tagen bereits ein undefinii'bares Chaos von Bakteriencolonien dar. Sind dann verflüssigende Arten unter den eingesäeten Bakterien, so fliesst die Grelatine gewöhnlich nach mehreren Tagen vom Glase herunter: „Die Platte ist verflüssigt" und damit definitiv unbrauchbar. Die Verdünnungen aber lassen wir so weit nicht kommen. Nachdem wir die Colonien zunächst bei schwacher VergTÖssermig untersucht, uns dann von der oder jener Colonie ein Präparat im hängenden Tropfen resp. ein gefärbtes Trocken- präparat angefertigt haben, mn uns durch Betrachtung bei starken Vergrösserungen weitere Aufschlüsse über die Colonien zu holen, be- nutzen wir diejenigen Colonien, die uns aus irgend welchem Grunde interessii-en, so lange sie noch isolirt in der Gelatine liegen, dazu, von ihnen Material zu entnehmen, um dieses in geeigneter Weise weiter zu züchten. Da die Colonie auf der Platte eine Reincultur war, so müssen jetzt auch die davon weiter gezüchteten Culturen Rein- en 1 1 u r e n repräsentii'en. Die Weiterzüchtungen werden gewöhnlich im Reagenz glase vorgenommen („Reagenz glas culturen"). Hat man das Material einmal in reinem Zustande auf den im Reagenzglase befindlichen Nähr- boden gebracht, so sorgt dann der Watteverschluss des Glases dafür, dass die Cultur rein bleibt. Die Reagenzgiasculturen eignen sich also vor Allem dazu, eine Sammlung lebender Bakterienreincul- turen dauernd im Stand zu erhalten.^) ^) Zu diesem Zweck ist es selbstverständlich nothwendig, dass die einzelnen Culturen zu rechter Zeit, d. h. ehe sie (durch eintretenden Nahrungsmangel, durch Austrocknen etc.) abgestorben sind, auf neuen Nährboden übertragen, „umgezüchtet" werden. Im Allgemeinen empfiehlt es sich , die Culturen in Zwischenräumen von etwa 4 bis 6 Wochen auf neuen Nährboden zu übertragen. — Es sei an dieser Stelle bemerkt, dass es sich bei dem Oeffnen einer Reagenzglascultur (behufs der Entnahme von Material) stets empfiehlt, nach der Entfernung des Wattepfropfs den Rand der OefFnung des Gläschens abzuglühen (in derselben Weise , wie es bei dem Anlegen von Plattenculturen [cf. oben p. 140] geschieht). Man vermeidet dadurch fast mit absoluter Sicherheit das Hineingelangen von verunreinigenden Stäubchen, die an der OefFnung des Glases hafteten, in die Cultur. Ebenso würde ich ganz allgemein empfehlen, auch jedes Reagenzglas, in welches hinein eine Uebertragung geschehen soll, nach Entfernung des Wattepfropfs an der Oeffnung durch Ausglühen zu sterilisiren. Ich beobachte diese Vorsichtsmassregeln seit Jahren und habe seit dieser Zeit fast nie die Verunreinigung einer Reagenzglascultur V. Allgemeine Methodik der Bakterienzüchtung. 151 Die gebräuchlichste Form der Reagenzgiascultiir ist che Gelatine- Stichcultiir. Um eine solche Cultur mit dem Material einer be- stimmten Plattencolonie anzulegen, verfährt man auf folgende Weise : Es wird zunächst die Colonie unter dem Mikroskope bei schwacher Vergrösserung, wie oben (p. 145) auseinandergesetzt, eingestellt. Man überzeugt sich, dass die Colonie auch thatsächlich isolirt liegt, dass sie ein homogenes, concentrisch gewachsenes G-anzes re- präsentirt, dass nicht etwa eine Nachbarcolonie ihre Grenzen ganz in die Nähe vorgeschoben oder gar Theile der Colonie verdeckt hat. A"on einer Colonie, die die letzteren Charactere zeigt, dürften wir nichts zur Weiterzüchtung entnehmen, da hier keine Bürgschaft für die Ueber- tragung thatsächlich reinen Materials vorhanden wäre. Haben wir aber eine Colonie gefunden, diö genügend isolirt innerhalb der klar durchsichtigen, d. h. sterilen, Gelatine liegt, so suchen wir nun (nach- dem wir den Tubus etwas in die Höhe geschraubt haben, ohne an der Lage der Platte auf dem Objecttische das Geringste zu ändern) mit blossen Augen festzustellen, welches die eingestellt gewesene Colonie ist. Es gelingt dies stets ohne Schwierigkeiten, wenn man central über der oberen Linse des Abbe 'sehen Beleuchtungsapparates die dort vorhandenen Colonien mit dem Auge aufsucht, ihre gegenseitige Lagerung, ihre Grössenverhältnisse etc. berücksichtigt. Man geht dann mit einem ausgeglühten und wieder erkalteten Platindraht (mit gerade endender Spitze) auf die Colonie zu und entninunt von ihr, aber nur von ihr, eine Spur mit der Spitze des Platindrahtes, i) Dieses Ent- nehmen des Materiales von der Platte bezeichnet man als „Fischen". Man nimmt nun ein Reagenzglas mit erstarrter Nährgelatine, bringt es zwischen Daumen und Zeigefinger der linken Hand so, dass die Oeffhung des Glases nach der Volarseite hin gerichtet ist, entfernt durch Drehen den Wattepfropf, bringt ihn in der oben ^) Wenn die Colonien ziemlich dicht zusammenliegen, so hat die sichere isolirte Entnahme des Materials von der central eingestellten Colonie naturgemäss ihre grossen Schwierigkeiten. Für solche Fälle hat Unna (Centralbl. f. Bakt. Bd. 11. 1892. p. 278) ein besonderes Instrument, die „Bakterienharpune" angegeben (von C. Zeiss in Jena zu beziehen): Nachdem man die Colonie mit schwachem System central eingestellt hat, hebt man den Tubus, schraubt das Objectiv ab und an seiner Stelle die Bakterienharpune (welche das Objectivgewiude trägt) an. Senkt man nun den Tubus wieder, so trifft eine an dem genannten Instrumente genau in der optischen Achse angebrachte Nähnadel mit ihrer (vorher ausgeglühten) Spitze genau die vorher central eingestellte Colonie. — Freymuth undLickfett (Deutsche med. Wochenschr. 1893. p. 457) haben die Bakterienharpune in der Weise modiflcirt, dass sie statt der Nähnadel eine an ihrem unteren Ende quer abgeschliffene Pravaz- Canüle anwenden, welche locheisenartig wirkt und die Colonie cürect aussticht. 152 ^- Allgemeines. (p. 140) geschilderten "Weise zAvischen 2. und 3. Finger der linken Hand und sticht nun, während man das Gläschen mit der Oeffinung nach unten gekehrt hält, den inficirten Platindraht unter vorsichtiger Vermeidung der Berührung der Griaswandungen central in die Gelatine hinein, bis nahe an den Boden des Glases.^) Man geht dann auf demselben Wege wieder aus der Gelatine heraus, glüht den Draht aus, stellt ihn bei Seite, bringt den Wattepfropf wieder auf das Reagenz- glas und bezeichnet nun das letztere dm*ch ein Etikett, welches — etwa 4 cm von der Oeffiiung des Glases entfernt — angeklebt wird, und welches die näheren Daten über das „eingestochene" Material und das Datmn augiebt. Nun überzeugt man sich durch Herunterschrauben des Tubus und nochmalige miki-oskopische Einstellung der vorher ein- gestellt gewesenen Plattenstelle davon., dass auch wirklich Material von der in der optischen Achse liegenden Colonie entnommen wurde. Dieselbe muss einen deutlich sichtbaren Defect zeigen. Die ISTachbar- colomen müssen unverletzt sein. Die Verschiedenheiten der Form, welche wir- bei den Plattencolonien gefunden haben, zeigen sich nun auch in entsprechender Weise bei der Form der S t i c h c u 1 1 u r e n wieder. Auch hier haben wir wieder die Unterschiede zwischen solchen Arten, die die Gelatine solide lassen, und solchen, die sie verflüssigen. Unter den ersteren finden wir solche, die im ganzen Bereiche des „Impf st ich es" gleich kräftig wachsen, andere, die besonders in den oberen Theilen desselben gedeihen. Die eine Art bildet halbkugelige Häufchen, nimmt nur einen kleinen Theil der Gelatineoberfläche in Anspruch; die andere hat die Tendenz, sich oberflächlich gleich in gTÖsserem Masse auszubreiten, ein dünnes Häut- chen zu bilden. Unter den verflüssigenden Arten verflüssigen ') Ist die Gelatine in dem Eöhrchen, in welches hinein der Einstich geschieht, nicht mehr ganz ft-isch, sondern bereits vor einigen Wochen hergestellt, so ist die Oberfläche des Nährbodens gewöhnhch etwas eingetrocknet (unter Ausbildung einer coucaven Einziehung), und das hat dann zur Folge, dass bei dem Emstechen des Platindrahtes die Gelatine in der Weise aus einander klafft, dass sich eine (grössere oder kleinere) keilförmige Lücke bildet. Dieses Yorkommniss ist ausser- ordenthch störend; die characteristischen Eigenthümlichkeiten, welche viele Bakterien- arten in ihrer Stichcultur darbieten , kommen an derartig beschaffenen Culturen so gut wie gar nicht zur Ausbildung. Man kann sich, wenn man für die Anlage einer Stichcultur fi-isch hergestellte Gelatine gerade nicht zur Verfügung hat, einigermassen dadurch helfen, dass man, bevor man den Einstich macht, das Gläschen unter schnellem Drehen um seine Längsachse wenige Secunden so in (Ue Flamme bringt, dass die obersten Partien der Gelatine etwas erwärmt werden. Hierbei löst sich die Gelatine an den eingetrockneten Partien vom Glase los , und ein Klaffen bei dem folgenden Einstich tritt nun nicht mehr ein. V. Allgemeine Methodik der Bakterienzüchtung. 153 die einen sehr langsam und allmählich die Gelatine, andere schneller, noch andere ausserordentlich rasch. Farbstoffproducirende Arten zeigen manchmal im ganzen Verlaufe des Impfstiches ebenso wie an der Oberfläche der Gelatine Farbstoffproduction ; andere Arten bilden nur an der Oberfläche der Gelatine Farbstoff, wachsen im ganzen Impfstiche farblos; noch andere endlich wachsen an der Oberfläche farblos, während sie im Impfstiche Farbstoff produciren. In den Stich- culturen findet man also das verschiedenartigste Verhalten, ebenso wie es auf der Platte der Fall war. Zu nennen ist hier ferner die Eigen- thümlichkeit vieler Arten, Gas zu produciren. Auf der Platte kommt diese Eigenschaft kaum zum Ausdruck; an der Stichcultur aber können wir dieselbe meist sehr deutlich constatiren: die Gelatine bekommt mehr oder weniger ausgedehnte Risse, welche von dem Impfstiche ausgehen. Wenn die Risse klein sind, so haben sie meist linsenförmige Gestalt. ^) Gelatine -Stichculturen sind abgebildet auf Taf. VI, Fig. 35; Taf. IX, Fig. 54; Taf. XI, Fig. 63; man bemerkt hier ohne Weiteres die augenfälligen Unterschiede in der Gestaltung der Stichcultur bei den verschiedenartigen Organismen. Eine andere Form der Reagenzglasculturen ist die b er fläche n - Strichcultur. Hier wird das Material nicht in die Gelatine ein- gestochen, sondern oberflächlich, gewöhnlich in einem einzigen, sehr dünnen Striche, auf den Nährboden aufgestrichen („Impf strich").-) ^) Die „gasbildenden" Bakterienarten zeigen die Eigenschaft der Gasbildung am besten auf solchen Nährböden, welche gährungs fähigen Zucker (am besten Traubenzucker) enthalten; in Gelatinestichculturen kommt die Gasbildung also namentlich dann zu unserer Kenntniss, wenn es sich um T r au benzucke r- Gelatine (cf. oben p. 124) handelt, in welche hinein der Einstich geschah. Nach Th. Smith (The fermentation tube. The wilder Quarter - Century Book. 1893. p. 197. — cf. auch das Autorreferat über diese Abhandlung im Centralbl. f. Bakt. Bd. 14. p. 864) kommt Gasbildung nur bei Anwesenheit von Zucker (oder Kohle- hydraten) im Nährboden vor; tritt bei Benutzung von Nährböden, welche keinen derartigen Zusatz erhalten haben, Gasbildung auf, so handelt es sich um Muskel- zucker, welcher in dem zur Herstellung des Nährbodens benutzten Fleisch wasser enthalten war. Das Gas, welches bei der Zuckervergährung durch Bakterien ent- steht, und welches besser als in Stichculturen in den bereits oben (p. 130) erwähnten „Gährungskölbchen"-Culturen beobachtet wird, ist gewöhnhch ein Gemisch von Wasserstoff und Kohlensäure; es hat, wie Th. Smith (1. c.) festgestellt hat, nicht immer eine und dieselbe Zusammensetzung; Smith hat verschiedene Typen der Gasbildung gefunden. -) Selbstverständlich hat man bei jeder Uebertragung für eine innige Verbin- dung des Impfmaterials mit dem Nährboden zu sorgen. Bei frischen (normal wasserhaltigen) Nährböden und frischem (feuchten) Bakterienmaterial ist diese innige 154 -A- Allgemeines. Am besten bedient man sich dazu solcher Eöhrchen, in denen der ^Nährboden (Glelatine, Agar, Blutserum) in schräger Lage zur Erstarrung gebracht worden ist (cf. oben p. 129), Ferner eignen sich hierzu die steriKsirten Kartoffelkeile, welche in Reagenz- gläschen eingeschlossen sind (cf. oben p. 134). Hat man nicht ver- flüssigende Arten vor sich, so kann man sie auf schräg erstarrter Gelatine oder auf Blutserum ausstreichen. Bei verflüssigenden Arten empfiehlt sich dies natürlich nicht; man nimmt hier zweck- mässig den nicht zu verflüssigenden Agar-Nährboden oder die Kar- toffel. Ebenso wie auf festen iSTährboden kann man natürlich auch auf flüssige sterile Nährböden, die im Reagenzglase unter Watte- verschluss enthalten sind, das reine Material der Plattencolonie über- tragen. Speciell empfiehlt sich für pathogene Organismen hierzu die oben (p. 129) erwähnte Nährbouillon. Man wählt die „Bouillon- cultur" besonders gern dann, wenn es sich um die Darstellung grösserer Mengen reinen Culturmaterials handelt, die für irgend welche Zwecke gebraucht werden sollen. (An entwickelten Bouillonculturen hat man verschiedene Dinge von allgemeiner Wichtigkeit zu beob- achten. Zunächst kommt hier die Frage in Betracht, ob die Haupt- masse der Nährboiüllon klar geblieben ist, oder ob sie sich getrübt hat. Ist sie klar geblieben, so finden wir die zur Entwickelung ge- langte Bakterienmasse in Form eines pulverigen oder wolkigen oder flockigen Sediments am Boden des Röhrchens; es handelt sich in solchen Fällen stets um eine unbewegliche Bakterienart. Hat man da- gegen eine eigenbeweghche Bakterienart in die Bouülon eingeimpft, so findet sich, nachdem die Cultur zm- Entwickelung gelangt ist, der iSTährboden stets zunächst gleichmässig getrübt, und erst später tritt dann eine Sedimentirung der Bakterienzellen ein. Ausser der Fi'age nach der eventuellen Trübung der Bouillon und der Beschaffenheit des event. vorhandenen Sediments hat man bei Bouillonculturen ferner die Frage zu berücksichtigen, ob sich an der Oberfläche des Nährbodens ein Häutchen entwickelt hat oder nicht; es giebt eine Reihe von Arten, welche ein solches Häutchen gewöhnhch zur Erscheinung kommen lassen, während anderen Arten diese Eigenschaft abgeht.) Auch in Reagenzgläser mit sterihsii-ter Milch (cf. oben p. 136), Verbindung durch blosses Aufstreichen ohne Weiteres hergestellt. Hat man trockenes Material (Pilzmycehen etc.) zu verimpfen, so empfiehlt es sich stets, der Oberfläche des Nährbodens zunächst kleine Verletzungen (durch Anstechen mit dem Platindraht) beizubringen und in diese hinein dann das Material sorgfältig einzubringen oder einzureiben. V. Allgemeine Methodik der Bakterienzücbtung. 155 mit sterilisirtem Urin, mit bestimmten chemisclien Nährlösnngen (cf. p. 137 ff.) etc. kann man das Material aus der Plattencolonie übertragen. So wie man diese Weiterzüchtungen aber im Reagenzglase vor- nehmen kann, so kann dies natürlich auch in beliebiger anderer Weise geschehen, z. B. auf den nach der ursprünglichen Koch' sehen oder nach der Esmarch'schen Methode präparirten Kartoffeln (cf. p. 132, 134). Solche Kartoffeln inficirt man am besten mit Hülfe eines Skalpells, welches ausgeglüht wurde und wieder erkaltet ist, und mit dessen in das Bakteriemnaterial getauchter Spitze man das Material in die Kar- toffelfläche eim-eibt. Die nach Koch 'scher Weise präparirte Kartoffel wird hierbei mit „Sublimatfingern" (cf. p. 133) festgehalten. Bei dem Inficiren der Kartoffel bleibt man mit dem inficirenden Skalpell gern 1 cm vom Eande der Kartoffel entfernt, da Verum-einigungen der Cultur, die von der Kartoffel selbst ausgehen, gewöhnlich am Rande der Kartoffel sich zuerst zeigen. Hierher gehören z. B. die die Kar- toffelculturen so oft verderbenden „Kartoffelbacillen", welche aus Sporen entstehen, die der Kartoffel äusserlich anhafteten und bei der Sterihsirung derselben nicht getödtet wurden. Ferner kann die Uebertragung von der Platte in einen hängen- den Tropfen (von Bouillon oder von Gelatine) hinein geschehen, der ebenso präparii't wii'd, wie oben (p. 53) angegeben, nur dass man ein steriles Deckglas (durch Erhitzen^) in der Flamme sterihsirt) und steriles Material für den Tropfen selbst wählt. Die sich entwickelnde „Cultur im hängenden Tropfen" gestattet, die Wachsthumserschei- nungen der Bakterien unter dem Mikroskope cürect zu verfolgen.^) Die ursprüngliche Koch 'sehe Plattenculturmethode ist nunmannich- fach modificirt worden. Zunächst ist hier ein Verfahren zu nennen. ^) Das Erhitzen soll hierbei nicht so weit gehen, dass, wie dies z. B. bei der Herstellung zu färbender Trockenpräparate oft nothwendig ist (cf oben p. 63, Anm. 1), das Deckglas völlig entfettet wird. Auf einem völlig entfetteten Deckglase nämlich lässt sich ein Bouillon t r o p fe n kaum herstellen: Der Tropfen zerläuft auf dem Glase, sobald er darauf gebracht worden ist, und breitet sich als gleichmässige Flüssigkeits- schicht aus. Es muss also noch eine spurweise Fettschicht zur Herstellung des Culturtropfens vorhanden sein. Man kann nun nachweisen, dass sich durch Erhitzung in der Flamme leicht eine sterile, aber doch nicht vollkommen fettfi'eie Deckglas- fläche herstellen lässt : Behufs der Sterilisirung sind niedrigere Temperaturgrade aus- reichend als behufs der vollständigen Entfettung. -) Bei solchem Material, welches bei Körpertemperatur besser wächst als bei Zimmertemperatur, wird das iVIikroskop zu diesem Behufs am besten so disponirt, dass der Objecttisch und das auf ihm liegende Culturpräparat in einem auf Körper- temperatur erwärmten Räume stehen (cf unten im Text: Besprechung des Brut- schrankes). 156 ^- Allgemeines. welches manche Yortheile vor dem m-sprünghchen Koch' sehen Ver- fahren darbietet, und welches von Petri^) stammt. Petri nimmt keine Glasplatten als Träger des Nährbodens, sondern an Stelle dieser runde Glasschälchen von 10 — 11 cm Durchmesser und 1 — 1,5 cm Höhe. Jedes Glasschälchen wird durch ein etwas grösseres, als Deckel dienendes ähnliches Schälchen vor Staub etc. geschützt. Die Doppel- schälchen werden, rein geputzt, auf einander gestellt, im Ti'ockenschrank sterilisirt (cf. p. 143) und können nach dem Erkalten benutzt werden. Ein besonderer „Giessapparat" wie bei dem Koch' sehen Verfahren ist hier nicht nöthig. Die Gelatine wird einfach eingegossen, die Schale zugedeckt, etikettii't und dann sich selbst überlassen. Diese Methode wird jetzt sehr viel, häufiger als die ursprüngliche Koch" sehe, an- gewandt. Es ist aber zu bemerken, dass die mikroskopische Unter- suchung-) derartiger Schälehenculturen etwas weniger bequem ist als die der Koch 'sehen Platten. Eine andere Modification der ursprünglichen Koch' sehen Platten- methode hat V. Esmareh") angegeben. Die Gelatine wii'd hierbei weder auf Platten noch in Schälchen ausgegossen, sondern an der Innenwand des Keagenz röhrchens, in dem sie sich befindet, direct ausgebreitet. Man bewerkstelligt dies so, dass man nach der Inficiiimg der geschmolzenen Gelatine den Wattepfifopf in das Pvöhrchen soweit hineinstösst, dass er vollständig im Glase verschwindet, dass man dann eine Gummikappe über die Oeähung des Röhrchens herüberzieht, die einen wasserdichten Abschluss bewirkt, und dass man nun das Eöhrchen horizontal auf die Oberfläche sehr kalten (event. Eis-) Wassers legt und dann das Eöhrchen mit den Fingern in (möglichst schnelle) Rotation versetzt.*) Die Gelatine wird dann bald fest und 1) Centralbl. f. Bakt. Bd. 1. 1887. No. 9. ^) Man kann diese Schälehenculturen mit schwachem System sowohl von oben her (nach Abhebung der Deckelschale) wie auch durch den Schälchenboden hindurch, also von der Unterseite her, mikroskopisch ansehen; in dem letzteren Falle braucht die Deckelschale selbstverständhch nicht entfernt zu werden. Ist die Oberfläche des Schälchenbodens an der unter dem Mikroskope liegenden SteUe so uneben, dass eine wesentUche Verzerrung des Bildes bei der Mikroskopirung durch diesen Boden hin- durch zu Stande kommt, so kann man sich dadurch helfen, dass man auf das Glas an dieser Stelle einen Tropfen Cedernöl und auf diesen ein Deckglas bringt. Man verleiht auf diese Weise dem Schälchen eine ebene Oberfläche, und die Bilder der hier liegenden Colonien erscheinen nun ohne jede Verzerrung. «) Zeitschr. f. Hyg. Bd. 1. 1886. *) Bei diesem Drehen des Röhrchens geht man am besten so vor, dass man das Eöhrchen nur an dem einen Ende, dort wo der Wattepfropf sich befindet, mit den Fingern (der rechten Hand) berührt. Während der bei der Drehung ein- V. Allgemeine Methodik der Bakterienzüchtung. 157 Überzieht das Glas an seiner Innenfläche mehr oder weniger gieich- mässig. Nachher wird das Köhrchen aus dem Wasser herausgenommen, die Gummikappe entfernt, das Röhrchen etikettirt und zur Entwickelung der Colonien hingestellt. Diese „RoUröhrchen", „Rollplatten" sind am besten von allen Plattenculturen gegen die Verunreinigung durch fremde Keime geschützt. Haben sich die isolirten Colonien mner- halb der „ausgerollten" Gelatine entwckelt, so kann man sie so- wohl mikroskopisch untersuchen (durch die Glaswand hindurch),^) als auch, unter Benutzung eines an der Spitze gekilimmten Platindrahtes, von ihnen Material zm* Anlage weiterer Culturen entnehmen. Eine derartige Rollplatte (oder wenigstens einen Theil von ihrj zeigt Fig. 26 auf Taf V. Dieselbe wurde mit Gartenerde angelegt. Man sieht hier im Centrum mehrerer Colonien noch die schwarzen Erdbröckelchen, von denen das Wachsthum ausgegangen ist. Die bis jetzt genannten Methoden der Plattencultur haben alle das Gemeinsame, dass sie zur Anlage einer jeden einzelnen Cultur ein besonderes Gelatmeröhrchen brauchen. Kommt es Einem im ge- gebenen Falle auch nur auf die die Verdünnungen enthaltenden Cultur- platten an, so ist man doch genöthigt, zunächst ein „Original" -Röhr- chen zu inficiren, um von diesem wieder Verdünnungsröhrchen anzu- legen. Eine Methode, welche Soyka^) angegeben hat, vereinfacht die Procedur und spart Material. S^o^ka empfiehlt Doppelschälchen zur Anlage der Plattenculturen, welche den Pe tri 'sehen im Allgemeinen ähnlich sind, sich aber dadurch von ihnen unterscheiden, dass in die untere 7 bis 8 oder mehr Vertiefungen (wie bei den hohl- geschliffenen Objectträgern) eingeschliffen sind. In jede der Ver- tretenden kurzen Pausen, in denen die Finger das Eöhrchen nicht berühren, sorgt dann jedesmal die Gravitation dafür, dass das Eöhrchen horizontal eingestellt wii-d. "Vor der Drehung thut man gut, zunächst alle Theile der Gefässwand mit der flüssigen Gelatine zu befeuchten; hierbei hat man darauf zu achten, dass nicht die ganze untere Fläche des Wattepfropfs, sondern nur die wandständigen TheUe des- selben mitbefeuchtet werden, weil anderenfalls — bei der folgenden Abkühlung des Eöhrchens im Eiswasser — im oberen Theile des Eöhrchens zahlreiche Luftblasen sich ansammeln. ^) Um das mikroskopische Bild bei dieser Gelegenheit besser zu gestalten, als es die geki-ümmte Aussenfläche des Eeagenzglases an und für sich zulässt, habe ich (cf. auch p. 156, Anm. 2) an der zu untersuchenden Stelle einen Tropfen Cedernöl auf die Glaswand gebracht und auf diesen ein Deckglas, dessen freie Oberfläche in senkrechte Eichtung zur optischen Achse des Mikroskopes gebracht wird. Man be- kommt so naturgemäss vortreffüche Bilder der Colonien. — Einen zweckmässigen Eea gen z glashalt er für die EoUplatten zum Aufsetzen auf den Objecttisch hat V. Sohlen (Zeitschr. f. wissensch. Mikroskopie. Bd. 7. 1890) angegeben. -) Deutsche med. Wochenschr. 1888. No. 43. 158 A.- Allgemeines. tiefluigen kommt eine kleine abgemessene Quantität geschmolzener Gelatine. Die Gelatine in einer der Vertiefungen wird dann mit dem in das Ausgangsmaterial getauchten Platindraht inficirt, und die wei- teren Verdünnungen werden dann durch Uebertragung von Material immer aus einer Vertiefung in die nächstfolgende bewerkstelligt. (Nach jeder einzelnen Uebertragung muss der Platindraht ausgeglüht werden.) Die Gelatine lässt man dann erstarren. Man hat so auf einer Platte alle Verdünnungen und hat sehr an Material gespart. Diesem sehr zweckmässigen S o y k a ' sehen A'erfahren schliesst sich ein Verfahren an, welches der Verf. zur Eeincultivirung, zur Isolirung von Bakterien häufig benutzt, und welches ebenfalls darauf gerichtet ist, Gelatine zu sparen resp. einen möglichst geringen Apparat für den einzelnen Versuch nothwendig zu haben. Ich bringe mir zunächst auf eine sterile Glasfläche (einen stark erhitzten und wieder erkalteten Objectträger oder die Innenfläche des Deckels eines steriü- sirten Pe tri 'sehen Schälchens, welches nachher für die Plattencultur zur Veiivendung kommen soll) 4 — 5 einzelne, isolirt liegende Tropfen steriler Bouillon oder sterilen Wassers, inficire dann den ersten Tropfen mittels des Platindrahtes mit dem zu untersuchenden Materiale, glühe den Draht aus, tauche ihn nach dem Erkalten in den ersten Tropfen wieder ein und übertrage die kleine anhaftende Menge in den zweiten Tropfen. Von diesem aus inficire ich (mit vorher aus- geglühtem Drahte) auf dieselbe Weise den dritten, von diesem den vierten, und ebenso auch eventuell einen fünften Tropfen je nach dem Bakterienreichthum des Ausgangsmateriales. Von dem letzten Tropfen übertrage ich dann eine Oese in ein Eöhrchen geschmolzener Nähr- gelatine und giesse die letztere dann, wie oben (p. 143) beschrieben, in ein Petri'sches Schälchen aus. Habe ich die Innenfläche des Deckels des Schälchens zur Anlage der Verdünnungen benutzt, so hat derselbe während dieser Zeit umgekehrt auf dem Schälchen ge- legen und so das Schälchen vor dem etwaigen Hineingelangen von Luftkeimen behütet. Die während der Entwickelung der Cultur an dem Deckel hängenden Ti'opfen schaden der Cultur natürlich durch- aus nichts. Anstatt der Gelatme kann man auch Agar zu Plattencul- tur en benutzen; und bei Organismen, welche erheblich besser und schneller bei Brüttemperatur wachsen als bei Zimmertemperatur, wird man mit Vorliebe zu dem Agar greifen. Nur ist hier ein besonders geschwindes Operiren durchaus geboten. Wie wir oben (p. 126) be- reits erwähnten, schmilzt das Nähr-Agar erst bei Temperaturen, die der Siedetemperatur des Wassers nahe liegen. Geschmolzen muss aber - 1 V. Allgemeine Methodik der Bakterienzüclitung. 159 jeder Nährboden werden, mit welchem wir eine Platte anlegen wollen. Nach dem Schmelzen wird das Agar abgekühlt bis etwas über 40*^ C. Man stellt das Röhrchen zu dem Zwecke am besten in ein entsprechend warmes Wasserbad ein. Bei dieser Temperatur ist das Agar gerade noch flüssig und doch schon kühl genug, dass man Bakterien ohne Gefahr für ihre weitere Entwickelungsfähigkeit einsäen kann. Nun muss man möglichst schnell das Material eintragen, vertheilen und dann die Verdünnungen machen, um hinterher den Nährboden gleich in P e t r i ' sehe KSchälchen ^) auszugiessen. Diese Schälchen werden in eine feuchte Kammer (p. 133) und mit dieser in den Brütschrank gestellt.^) Will man das Agar zu Rollplatten (cf. oben p. 157) ver- wenden, die in den Brütschrank gestellt werden sollen, so darf man nicht das gewöhnliche 1 i/o procentige , sondern muss 2 procentiges (cf oben p. 126) Agar verwenden, weil nur bei dieser Concentration die Agarschicht auch bei längerem Aufenthalt im Brütschrank an den Wandungen des Glases sicher haftet (C. Fränkel*^)). v. Esmarch*) setzt zur Verhütung der Ablösung der Agarschicht dem li/^proc. Agar mehrere Ti'opfen einer sterilisirten dicken Lösung von Gummi arabicum zu. ^) Cxiesst man das inficirte Agar auf gewöhnliche Koch'sohe Platten aus, so dürfen diese Platten nicht wie bei der Anlage von Gelatinei^latten möglichst stark abgekühlt (cf. p. 143) sein, sondern die Spiegelplatte des Giessapparates muss für diesen Zweck sogar durch lauwarmes Wasser etwas angewärmt sein. Je schneller nämlich das Agar auf den Platten erstarrt, desto weniger gut haftet es am Glase. Auf die so angewärmten Platten trägt man vor dem Aufgiessen des Agars zweck- mässig noch je mehrere Tropfen Siegellack auf, welche das Abgleiten der Agarschicht vom Glase nach der Erstanning verhüten. ") Häufig erlebt man es, dass nach 24 Stunden die gesammte Oberfläche der Agarschicht in den Schälchen sich mit einer gleichmässigen Bakterienwucherung be- deckt zeigt. Es handelt sich hier um die Eigen thümlichkeit des Agars, beim Er- starren Wasser auszupressen (cf. p. 129); die Oberfläche überzieht sich zunächst mit einer Schicht derartigen ,,Condensationswassers", und diese Wasserschicht wird dann sehr leicht zu einem Vermehrungsort von Bakterien. Selbstverständlich ist unter solchen Umständen die Platte zur Isohrung der eingesäeten Keime nicht mehr zu brauchen, der eigentliche Zweck des Versuches also verfehlt. Um dieser un- angenehmen Eventualität zu entgehen, hat Zabolotny (Deutsche med. Wochenschr. 1893. p. 1353) vorgeschlagen, die Agarschalen nicht horizontal, sondern schräg ge- neigt aufzustellen: das Condensationswasser sammelt sich bald in den abhängigen Theileu der Schale, und die Hauptmasse des Nährbodens wird von dem flüssigen Oberflächenbelage befreit. Freudenreich (Centralbl. f. Bakt. Bd. 15. 1894. p. 643) sowie Miller (ebenda p. 895) stellen die Agarschalen aus denselben Grün- den umgekehrt (den Deckel nach unten gerichtet) auf. ^) Centralbl. f. Bakt. Bd. 3. 1888. ■ p. 767. *) Zeitschr. f. Hyg. Bd. 1. 1886. p. 301. 160 A-. Allgemeines. Auch für Agarplatten hat sich mir meine, der Soyka'schen nachgebildete Verdünnungsmethode fcf. p. 158) bewährt. Eine Methode, Blutserum für Plattenculturen zu ver- wenden, hat Hueppe^) angegeben. Das flüssige, steril aufgefangene oder (im flüssigen Zustande) sterilisirte (cf. p. 131) Blutserum wird auf c. 40*^ C. erwärmt und mit dem zu untersuchenden Bakterien- materiale beschickt, welches gieichmässig darin vertheilt wird. Event, werden von dem so hergestellten Originalröhrchen Verdünnungen (wie bei der Gelatineplattencultur, p. 1 42) hergestellt. Inzwischen ist 2 pro- centiges Nähr- Agar geschmolzen und auf 42*^ C. wieder abgekühlt worden. Das inficii'te Serum wird nun mit etwa der gleichen Quan- tität Agar sorgfältig vermischt; das Gemisch wird in Schälchen aus- gegossen, in welchen es erstarrt, und che dann in den Brütschrank kommen. Ehe Koch seine Plattenmethode erfand, benutzte er die Nähr- gelatine in etwas anderer Weise zur Isolirung der Keime. Er inficirte nämlich den Platindraht und strich denselben dann mit der Spitze über die Oberfläche von Nährgelatine, welche auf einem sterilisirten Objectträger in dünner Schicht ausgegossen war. Neben einander wurden so eine Anzahl „Impf striche" gemacht. Die Mehrzahl der dem Draht anhaftenden Keime blieb natürlich schon beim ersten Striche an der Gelatine hängen, der zweite Strich erhielt schon weniger Keime ; und bald kam bei den nächstfolgenden Strichen ein Zeitpunkt, wo nur hier und da ein einzelner Keim sitzen blieb. Die Object- träger wurden dann in die feuchte Kammer gestellt. Mit Hülfe dieser „Objectträgerculturen" erzielte Koch die ersten isolirten Rein- cultm-en aus Bakteriengemischen. -) Eine Plattencultur , welche nach dem genannten Principe angelegt wurde, zeigt Taf. VI, Fig. 32 (cf. oben p. 149). Dieses Princip der Isolirung von Keimen durch Anlegung einer Reihe von Oberflächen- Strichculturen wendet man in der bakterio- logischen Praxis sehr häufig — wenn auch in einer von der Objecto trägermethode abweichenden Form — an, und zwar zum Zwecke der Isolirung patho gener Keime aus Material, welches dii'ect aus dem erkrankten Körper stammt. Der mit dem Originalmaterial (Blut, Eiter, diphtherische Pseudomembran etc.) inficirte Platindraht wird hinter einander auf der Oberfläche des (schräg erstarrten [p. 129]) Nähr- bodens von 4 bis 6 bis 8 Reagenzröhrchen (Agar, Glj^cerinagar, Blut- serum etc.) ausgestrichen. Die inficirten Röhrchen kommen in den 1) Centralbl. t. Bakt Bd. 1. 1887. p. 610. •-) Mtth. a. d. Kais. Ges.-Amte. Bd. 1. 1881. p. V. Allgemeine Methodik der Bakterienzüchtung. 161 Brutschrank. In den letzten Röhrclien kommen isolirte Colonien zm- Entwickelung. ^) Will man Bakteriencnlturen conserviren, so geht man gewöhnlich so vor, dass man, sobald das Wachsthnm eine gewisse Höhe erreicht hat, die Culturgefässe gegen die Atmosphäre luftdicht abschliesst. Das Letztere geschieht entweder durch sorgfältiges Ver- kitten der Deckel etc. mit Paraffin oder durch Zuschmelzen der Oeff- nungen der G-efässe. Das Zuschmelzen lässt sich aber gewöhnlich nur bei Reagenzgiasculturen bewerkstelligen. Durch den luftdichten Ver- schluss des Culturgefässes wird eine Verdunstung der in dem Nähr- boden enthaltenen Feuchtigkeit sowie die Möglichkeit der Verunreinigung dauernd ausgeschlossen. Ausserdem wird der weiteren Entwickelung der Cultm* durch den luftdichten Abschluss meist bald ein Ziel ge- setzt (Abschluss von Sauerstoff). Um den Ausbau der hierher ge- hörigen Conservirungsmethoden haben sich besonders verdient gemacht Soyka^), Soyka und Kral"), Kräl'^), Czaplewski.^) Man kann sich nach diesen Methoden sehr schöne Sammlungen bakterio- logischer Culturen anlegen („bakteriologische Museen"). Die Culturen behalten unter luftdichtem Verschluss sehr lange Zeit ihre Uebertrag- barkeit bei. Eine von dem geschilderten Princip abweichende Methode der Con- servirung von Bakteriencnlturen hat Häuser**) angegeben. Hauser benutzt zu diesem Zwecke Formaldehyddämpfe. Der Formaldehyd, welcher in c. 40proc. Lösung unter dem Namen „Formalin" im Handel zu haben ist, ist bekannthch (cf. oben p. 34) em ziemlich energisch bakterientödtendes Mittel. Werden Bakteriencnlturen den Dämpfen des Formalins ausgesetzt, so erfolgt zunächst Entwickelungshemmung, dann Abtödtung der Culturen. Sehr mchtig ist nun die Thatsache, dass, obgleich eine Abtödtung des Bakterienmaterials erfolgt, der Eindruck, den die Cultur dem Auge gewährt, völlig erhalten bleibt ; eine fernere wichtige Thatsache ist die, dass Grelatine, die durch Bakterienwachsthmn verflüssigt worden ist, unter dem Einflüsse der Formalindämpfe wieder ^) Selbstverständüch kann man zum Zwecke der Isolirung pathogeuer Keime nach diesem Princip auch Agar verwenden, welches geschmolzen, dann in Schälchen ausgegossen und dort zur Erstarrung gebracht wurde. Wegen der Aufstellung solcher Schälchen im Brütschrank vgl. p. 159, Anm. 2. -) Centralbl. f. Bakt. Bd. 1. 1887. No. 18. ^) Zeitschr. f. Hyg. Bd. 4. 188S. *) Zeitschr. f. Hyg. Bd. 5. 1889. ^) Centralbl. f, Bakt. Bd. 6. 1889. No. 15. •^) Münchener med. Wochenschr. 1893. No. 30. Günther, Bakteriologie. 4. Auflage. 11 162 A. Allgemeines. vollständig fest wird/) dass aber auch hierbei der optische Eindruck der flüssigen Gelatine völlig erhalten bleibt. Bezüglich des praktischen Vorgehens bei der Fornialinmethode hat Hause r folgende Vorschriften gegeben: Plattengüsse in Schälchen, die conservirt werden sollen, erhalten unter dem Deckel eine Einlage von Filtrü-papier, auf welches man 10 — 15 Tropfen Formalin träufelt; hierauf bringt man die ge- schlossenen Schalen in eine mit stark angefeuchtetem Fliesspapier aus- gekleidete feuchte Kammer (grosse Doppelschale Q). 133]); in diese stellt man noch ein offenes Schälchen, in welches man etwas Watte legt, die mit Formalin angefeuchtet wird. Zu conservirende Reagenz- glasculturen werden mit losem Wattepft-opf, der am unteren Ende mit 8 — 10 Tropfen Formalin angefeuchtet wird, geschlossen, dann in ein cylindrisches, luftdicht zu verschliessendes Grefäss eingestellt, auf dessen Boden sich Watte, die mit Formahn befeuchtet ist, befindet; täghch werden hier einige Tropfen Formalin zugegossen. — Die For- maUnmethode eignet sich vortrefflich dazu, Bakterienculturen für kürzere Zeit (z. B. zu Demonstrationszwecken) zu conserviren. Selbst- verständlich ist auch hier, wenn man wirkliche Dauei-präparate wünscht, ein luftdichter Abschluss, der das allmähliche Vertrocbien verhindert, nicht zu entbehren. Man hat auch versucht, Culturen in festem Nährboden in Form des mikroskopischen Präparates zu conserviren. Handelt es sich um Plattenculturen, so muss die zu conservirende Stelle mit dem Messer umschnitten und dann zwischen Objectträger und Deck- glas (in Glycerin z. B.) eingeschlossen werden. Derartige Methoden haben Garre^), Plaut''), Lipez^), Jacobi'^) sowie der Verf.*^) angegeben. Haus er') hat gefunden, dass sich auch für diesen Zweck ganz besonders gut die (vorstehend besprochene) Formalinmethode eignet: Die Culturplatte wird zunächst durch Formalindämpfe ge- härtet; dann wii-d die zu conservirende Stelle mit einem Messer um- schnitten, vorsichtig von dem Glase abgelöst, auf den Objectträger gelegt, mit geschmolzener Gelatine eingeschlossen und mit einem Deck- ^) Auch durch Erhitzen lässt sich solche „Formahn -Gelatme", wie Hauser weiterhin (Münch. med. Wochenschr. 1893. No. 35) festgestellt hat, nicht mehr flüssig machen. ■-) Fortschr. d. Med. 18S6. No. 12. -) Fortschr. d. Med. 18S6. No. 13. *) Centralbl. f. Bakt. Bd. 1. 1887. No. 13. •^) Centralbl. f. Bakt. Bd. 3. 1888. No. 17. •*) Deutsche med. Wochenschr. 1889. No. 20. ') Münch. med. Wochenschr. 1893. No. 35. V. Allgemeine Methodik der Bakterienzüchtung. 163 glase bedeckt. Hierauf stellt man das Präparat noch etwa 24 Stunden in die Fomialinkammer, wo die zum Einschluss benutzte Gelatine eben- falls erstarrt mid unlöslich wird. Zum Schlüsse wird das Präparat durch einen Lackrahmen (cf. p. 68, Anm. 2) vor Eintrocknung ge- schützt. — Handelt es sich um Eeagenzglasculturen, die in Form des mikroskopischen Präparates conservirt werden sollen, so muss die die Cultur enthaltende Gelatine zimächst gehärtet und dann in Schnitte zerlegt werden. Solche Methoden haben FischP) und Neisser^) publicirt. Die bisher besprochenen Culturmethoden , speciell die Platten- methode, gehen von der Voraussetzung aus, dass wir solche Organismen zu untersuchen haben, welche an der Luft zu wachsen ver- mögen. Wir haben nun früher bereits (p. 22) gesehen, dass es eine gTOsse Eeihe von Bakterienarten giebt, denen dies Vermögen abgeht, die im Gegentheil durch die Gegenwart freien Sauerstoffs in ihrer Ent- wickelung gehemmt werden. Es sind dies die sogenannten Anaeroben (auch „obligate", „strenge" Anaeroben genannt). Haben wir solche Organismen zu züchten, so kann dies natüi'lich nicht in. der ge- wöhnhchen Weise auf der Platte geschehen; denn der atmosphärische Sauerstoff, welcher zu der Platte ungehinderten Zutritt hat, würde ein jedes Wachsthum von vornherein iahibiren. Will man derartige Or- ganismen zum Wachsthum, zur Vermehrung briagen, so muss man den atmosphärischen Sauerstoff von dem Orte, an dem das Wachsthum geschehen soll, sorgfältigst fernhalten. Nach verschiedenen Principien kann dies geschehen. Man kann, wie dies zuerst (1878) Pasteur, Joubert und Chamberland'^) thaten, den inficirten Nährboden in einen Raum bringen, der nachher luftleer gepumpt wii'd;^) oder man kann, nach Büchner,'^) aus ^) Fortschr. d. Med. 1887. No. 20. 2) Centralbl. f. Bakt. Bd. 3. 1888. No. 16. ^) Comptes rendus de l'Acad. des sciences. Paris, t. 86. 1878. p. 1038 ff. *) Gruber (Centralbl. f. Bakt. Bd. 1. 1887. No. 12) benutzt zu diesem Zwecke lange, im oberen Drittel verengte Keagenzgläser, welche — nach der Be- schickung der in ihnen befindlichen Näkrgelatine mit dem Bakterienmaterial — mit der Luftpumpe in Verbindung gesetzt und nach dem Evacuiren an der verengten Stelle luftdicht abgeschmolzen werden. Dann wird die Gelatine in ihnen nach der Esmarch' sehen Methode (oben p. 156) ausgerollt. — Einen einfachen Apparat für die Anstellung von Culturen im luftleeren Eanme, der auch zur Herstellung einer Wasserstoffatraosphäre (cf. oben im Text weiter) zu benutzen ist, hat Novy (Cen- tralbl. f. Bakt. Bd. 14. 1893. p. 592 und Bd. 16. 1894. p. 566) angegeben. — Einen ähnlichen Apparat gab bereits vorher (1892; Virch. Arch. Bd. 128) Nico- laier an (cf. Centralbl.. f. Bakt. Bd. 15. 1894. p. 227). ö) Cenü-albl. f. Bakt. Bd. 4. 1888. No. 5. 11* Jß4 -^- Allgemeines. dem Eaume, in welchem der inficirte Nährboden resp. das Cnltur- gefäss (z. B. eine nach Esmarch angelegte Rollplatte) steht, den Luftsauerstoff fortschaffen durch alkalische Lösung von Pyro- gallol (1 g Pn-ogallol, 1 ccm Liqu. Kai. caust., 10 ccm Wasser), welche bekanntlich ein ausserordenthch sauerstoffgieriges Medium ist. i) Man kann aber den Luft.sauerstoff resp. die atmosphärische Luft auch entfernen, indem man in den den Nährboden umgebenden Raum ge- nügend lange Zeit reinen Wasserstoff^) einleitet, indem man eventuell sogar dm'ch den Nährboden selbst (bei Gelatine vor der Er- starrung) Wasserstoff durchleitet. Wird nachher ein sicherer Verschluss nach aussen hin hergestellt (durch Zuschmelzen der Glasgefässe, durch Verkitten der Oeflhungen mit Paraffin), so gedeihen die Anaeroben in ausgezeichneter Weise in dieser Wasserstoffatmosphäre. ■^) ^) Diese vortreffliche Buchner'scbe Methode ist später von Nikiforoff (Zeitschr. f. Hyg. Bd. 8. 1890) zur Cultivirung der Anaeroben im hängen- den Tropfen verwendet worden. Nikiforoff umstreicht die Höhlung des hohl- geschüffenen Objectträgers wie gewöhnlich (cf. oben p. 53) mit Vaselin und drückt dann das mit dem geimpften (inficirten) Tropfen versehene Deckglas (cf. oben p. 155) so auf diesen Objectträger, dass die Höhlung des letzteren an einer Stelle nicht vöUig vom Deckglase verschlossen wird. Diese freigelassene Stehe wird nun an ihrem einen Ende mit starker wässeriger PyrogaUoUösung (mit Hülfe einer Platin- öse) betupft, während an das andere Ende ein Tröpfchen Kalilauge gebracht wird. Sodann wird durch Verschiebung des Deckgläschens die Höhlung des Objectträgers vöUig verschlossen. Es mischen sich dann die beiden Eeagentien mit einander; sie bleiben an der BerührungssteUe von Objectti'äger und Deckglas hängen, kommen mit dem Culturtropfen nicht in Berührung. ^) Der aus „reinem" Zink und „reiner" Schwefel- oder Salzsäure bereitete Wasserstoff wird (nach C Fränkel; Centralbl. f. Baki:. Bd. 3. 1888. p. 768) be- hufs der Eeinigung von eventuellen Verunreinigungen am besten durch 3 Wasch- flaschen geleitet, welche der Eeihe nach enthalten 1) alkalische Bleilösung (zur Ab- sorption etwaiger Schwefelwasserstoffspuren), 2) Silbernitratlösung (zur Absorption etwaigen Arsen Wasserstoffs), 3) alkahsche PyrogaUoUösung (zur Absorption etwaigen Sauerstoffs). ^) BezügHch der vielfachen hierfür angegebenen Methoden, um deren ersten Ausbau sich namentUch H. und E. Buchner, Hauser, Liborius, Eoux (1885 bis 1887) verdient gemacht haben, verweise ich im Allgemeinen auf Hueppe's „Methoden der Bakterienforschung", 5. Aufl. 1891. p. 361 ff. — Kitasato (Zeitschr. f. Hyg. Bd. 7. 1889. p. 227) gab zur Anlegung von Plattenculturen flache Glasgefässe an, durch welche Wasserstoff hindurch geleitet wird, und die dann luft- dicht zugeschmolzen werden. — Gabritschewsky (Centralbl. f. Bakt. Bd. 10. 1891. p. 249) hat (sehr empfehlenswerthe) Culturschalen für Wasserstoffdurchleitung und gleichzeitige Sauerstoffabsorption durch Pyrogallol angegeben, bei welchen eine Zuschmelzung nicht vorgenommen zu werden braucht. — Aehnliche Schälchen, bei denen aber nur Wasserstoffdurchleituug , nicht Pyrogallol zur Verwendung gelangt, hat Kamen (Centralbl. f. Bakt. Bd. 12. 1892. No. 9) beschrieben. — Eine höchst V. Allgeiueine Methodik der Bakterienzüchtung. 165 Es ist an dieser Stelle darauf hinzuweisen, dass man nicht etwa Kohlensäure zur Verdi'ängung des Luftsauerstoffs benutzen darf. Es hat sich, besonders durch umfassende Untersuchungen, die C. Eränkel^) angestellt hat, gezeigt, dass die Kohlensäure, wie für andere Organismen, so auch für die Bakterien im Allgemeinen ein Gift ist, und dies sowohl für- Aeroben wie Anaeroben.-) Der Wasserstoff ist jedoch, wie für andere Organismen, so auch für die Bakterien ein völlig indifferentes Gas. Von Plattenculturen kann man den Luftsauerstoff nach Koch'') dadurch fernhalten, dass man auf die Gelatine etc. ein dünnes Glimmerplättchen, welches vorher durch Ausglühen sterilisirt wurde, auflegt. Dasselbe muss natürlich eine grössere Ausdehnung besitzen. Unter demselben kommen die Anaeroben zur Entwickelung. Das geschilderte Verfahren lässt sich auch sehr gut zur Prüfimg des Sauerstoffbedürfnisses bestimmter neu aufgefimdener Arten benutzen.^) Ganz besonders gut für den letztgenannten Zweck eignen sich auch die bereits oben (jd. 130, 153) erwähnten Gährungskölbchen.^) einfache Methode der Wasserstoffbenutzung hat Fuchs (Dissert. Greifswald. 1890) angegeben. Siehe hierüber Loeffler (Centr. f. Bakt. Bd 7. 1890. No. 20. p. 635): „Die Methode besteht darin, dass das besäete Köhrchen umgedreht, und, nachdem einige Minuten hindurch Wasserstoff mit einem Glasrohr eingeleitet worden ist. mit einem Gummistopfen von unten her fest verschlossen wird. Der Gummistopfen kann zur Vorsicht noch paraffinirt werden." — Blücher (Zeitschr. f. Hyg. Bd. 8. 1890) cultivirt Anaeroben auf der Platte (Petri'sches Schälchen), auf Kar- toffeln etc. unter einer Glasglocke, in welche Wasserstoff eingeleitet wird, und deren Inneres durch eine wässerige Glyceriulösung (1 Glycerin + 3 bis 4 Wasser) gegen die äussere Luft abgesperrt wird. — Botkin (Zeitschr. f. Hyg. Bd. 9. 1890) hat ein ähnliches Verfahren angegeben, bei welchem Paraffin um liquidum als Absperrflüssigkeit verwandt wird. 1) Zeitschr. f. Hyg. Bd. 5. 1888. ^) Das gilt jedoch nicht ohne Ausnahme. Es giebt Anaeroben, welche ganz gut in der Kohlensäureatmosphäre gedeihen. ^) Deutsche med. Wochenschr. 188-1. p. 502. ■*) Nach neueren Mittheilungen von Braatz (Centralbl. f. Bakt. 1. Abth. Bd. 17. 1895. p. 741) ist das Letztere nicht der Fall. ^) Allerdings gilt dies nur für den Fall, dass die zu untersuchende Art eigen- beweglich ist. Hat man kurz vor der Impfung des Gährungskölbchens dafür ge- sorgt, dass der in der Nähi-flüssigkeit enthaltene fi-eie Sauerstoff durch Erhitzung des Kölbcheus im Dampftopf entfernt wurde, so findet man, sobald man eine streng Sauerstoff bedürftige Art einimpft, dass eine Vermehrung der Bakterien nur in der Kugel des Gährungskölbchens, d. h. in demjenigen Theile desselben, der mit dem freien atmosphärischen Sauerstoff in dauerndem Contact ist, eintritt; die Flüssigkeit in dem aufsteigenden (geschlossenen) Schenkel des Kölbchens bleibt in solchen Fällen absolut klar. Umgekehrt sieht man bei solchen Arten, die auch unter Abschluss von freiem Sauerstoff zu gedeihen vermögen (die meisten pathogenen Arten verhalten IQQ A. Allgemeines. Sehr bequem zur Züchtung der Anaeroben, wenn auch zur Iso- lirung der Keime aus emem Gemische weniger brauchbar, ist eine andere Methode, bei welcher der Sauerstoif der atmosphärischen Luft von der Cultur durch da rüber geschichtetes festes Nährsubstrat abgeschlossen wird.i) Nach diesem einfachen Principe kann man z. B. aus Keinculturen von Anaeroben Stichculturen in jedem Grelatineröhr- chen anlegen. Man sticht das Material in der gewöhnlichen Weise mit dem Platindraht tief in die Gelatine ein und sieht nachher in den tieferen Schichten der Gelatine, zu denen der atmosphärische Sauer- stoff keinen Zutritt hat, bis etwa 1 '/2 cm von der Gelatineoberfläche entfernt, von dem Impfstiche das Wachsthum der anaeroben Cultur ausgehen, während in den oberen Schichten der Gelatine, die mit dem atmosphärischen Sauerstoff in Berührung sind, jedes Wachsthum unter- bleibt. Man kann auch das Bakterienmaterial in geschmolzener Gelatine vertheilen und die Gelatine dann wieder erstarren lassen. Man beob- achtet dann in den unteren Partien der Gelatine die Entwicklung mehr oder weniger von einander isolirter Colonien. Eine solche Cultur zeigt z. B. Fig. 39 auf Taf. VII. Kommt es Einem darauf an, von derartigen, isolirten Colonien Abimpfungen zu machen (um das Material in reinem Zustande zu erhalten), so ist es vielleicht das Zweckmässigste, das Eöhrchen etwas zu erwärmen, so dass die gesammte Masse des Nährbodens aus dem Röhrchen herausgleiten kann. Dann ist es leicht, einzelne Colonien behufs isoKrter Abimpfung mit dem Platindraht zu treffen. ^) Es empfiehlt sich zur Cultur anaerober Organismen den Nähr- böden gewisse reducirende Substanzen zuzusetzen. Das Wachsthum erfolgt dann schneller. Liborius") fand einen Zu- sich ja so [cf. p. 22]) , dass auch in dem aufsteigenden , d. h. von der Atmosphäre abgeschlossenen, Schenkel des Kölbchens Vermehrung der Bakterien, d. h. Trübung der Nährlösung, eintritt. — Beyerinck hat die Gährungskölbchen auch dazu be- nutzt, um streng anaerobe Bakterienarten aus Bakteriengemischen rein zu cultivireu. Von dem genannten Autor angegebene (Centralbl. f. Bakt. Abth. II. Bd. 1. 1S95. p. 104 ff.) raodificirte Gährungskölchen (sog. „Trennungskölbchen") gestatten, die in dem geschlossenen Schenkel entwickelten strengen Anaeroben von anderem, mitcultivirtem, aerobem Materiale zu trennen. ^) Diese Methode wurde zuerst von W. und E. Hesse (Deutsche med. Wochen- schrift. 1885. No. 14) angegeben, dann von Liborius (Zeitschr. f. Hyg. Bd. 1. 1886. p. 119 ff.) weiter ausgebildet. 2) Sanfelice (Zeitschr. f. Hyg. Bd. 14. 1S93. p. 346) benutzt diese Methode zur behebigen Herstellung von Eeinculturen anaerober pathogener Bakterienarten, und zwar unter Verwendung von Agar. ») Zeitschr. f. Hyg. Bd. 1. 1S86. p. 168. V. Allgemeine Methodik der Bakterienzüchtung. 167 satz von 2°/^ Traubenzucker zu der Xährgelatine wachsthums- beschleunigend ; K i t a s a t o und W e y 1 ^) haben später für den gleichen Zweck einen Zusatz von 0,3 — 0,5 ^/q ameisensaurem Natron zu Nähragar empfohlen. Kurz vor der Benutzung sollen die zur Anaeroben- cultur zu verwendenden Nährböden stets kurz aufgekocht werden (zur Austreibung gelösten Sauerstoffs), sodann sollen sie schnell abgekühlt werden. Die Cultm-en der Bakterien, aerober sowohl -wie anaerober, können nun, mag es sich um Platten- oder Reagenzglasculturen oder um Kartoffelculturen in der feuchten Kammer handeln, bei den verschie- densten Temperaturen gezüchtet werden. Die gebräuchlichsten sind die Zimmertemperatur (18 — 22*^ C.) und die Brüt- (Blut-) Temperatur (c. 35 — 38 ^C). Gelatineculturen eignen sich natürlich nicht zur Züchtung bei Brüttemperatm-, da die Gelatine schon bei 25^ C. sehr weich und bei wenig höherer Temperatur flüssig wird. Bei 22^ C. kann man dagegen die Gelatineculturen noch sehr gut halten. Und bei dieser Temperatur zeigen auch fast alle diejenigen Organismen, die am besten bei Brüttemperatur gedeihen, d. h. die für Warmblüter pathogenen, noch Wachsthmn. Für Züchtungen bei Brüt- temperatur nimmt man Agar, Bouillon, Blutserum, Kartoffeln etc. Die Nährböden kommen hierbei am besten in Reagenzröhrchen resp. in Petri'schen Schälchen (bei Agarplatten) eingeschlossen zur Ver- wendung; denn irgend welche Verunreinigungen der Cultur machen sich bei Brüttemperatur gleich in viel ausgedehnterem Masse geltend als bei Zimmertemperatur, und die genannten Dispositionen schützen die Nährböden am besten vor Verimreinigungen. Ist das Wachsthum der zu züchtenden Art ein sehr langsames, so ist ein langer Aufenthalt in dem künsthch auf Brüttemperatur erwärmten Räume (Brütschrank, Brütofen) nothwendig, und dabei trocknen dann die Nährböden ge- wöhnlich ziemlich schnell ein. Besonders ihre Oberfläche wird dann bald so wasserarm, dass sie das Bakterienwachsthum nicht mehr ge- stattet. Man muss in solchen Fällen die Züchtung in Reagenzgläsern vornehmen und von vornherein für einen luftdichten Verschluss derselben sorgen. Nothwendig wird dies z. B. bei der künstlichen Züchtung der Tuberkelbacillen auf Blutserum, auf Glycerinagar. Man überzieht dann die Oeffnung des Reagenzglases, nachdem man den Wattepfropf tief hineingestossen hat, mit einer Gummikappe. Würde man dies aber ohne besondere Vorsichtsmassregeln thun, so würden sich die an dem Wattepfropf aussen aufsitzenden, aus der Luft stani- 1) Zeitscbr. f. Hyg. Bd. 8. 1890. p. 43. Ißg A. Allgemeiues. menclen Keime in der geschaffenen feuchten Kammer baldigst zu ent- wickeln beginnen, und es würden mm namentlich die Pilzmycehen die Poren des Pfropfs durchwuchern und die Cultur, deren Züchtung wir beabsichtigten, verderben resp. gar nicht zu Stande kommen lassen. Deshalb geht man in solchen Fällen so vor, dass man den mit der Pincette gefassten Wattepfi'opf zunächst äusserlich in der Flamme abbrennt, um alle anhaftenden Keime zu vernichten, dann ihn in den erhitzten Hals des Röhrchens hineinschiebt und schliessHch eine Gummikappe überzieht, welche stundenlang in Sublimatlösung ge- legen hat. Der Brütschrank, dessen man sich zu Culturzwecken bedient, (Brütofen, Wärmeschrank, Vegetationskasten, Thermo- stat) kann verschieden construirt sein. Wesentlich ist ein abgeschlos- sener, gegen Wärmeabgabe nach aussen möglichst gesicherter Raum, dessen Inneres auf constanter Temperatur erhalten wii'd. Meist sind fiii- diesen Zweck doppelwandige , aussen mit Filz oder Asbest bekleidete Kästen von starkem Kupferblech \) in Gebrauch, die mit einer vom angebrachten Doppelthür versehen sind. Zwischen den beiden Wandungen des Kastens befindet sich Wasser, in welchem auf der einen Seite ein aussen ablesbares Thermometer, auf der anderen ein (noch zu besprechender) Thermoregulator steht. Der ganze Kasten steht auf einem Vierfussgestell und wfrd erwärmt durch eine besondere Siehe rheits- (Gas-) Lampe, zu der das Gas durch den Thermoregulator hindurch gelangt. Die Lampe ist so eingerichtet, dass bei zufälligem Verlöschen der Flamme (durch vor- übergehendes Absperren der Leitung etc.) der Hahn automatisch ge- schlossen wird. Man hat auch Brütschränke construirt, in welche das Mikro- skopstativ so eingesetzt werden kann, dass der Objecttisch und seine Umgebung, speciell das auf dem Objecttisch befindliche Präparat mit dem (lebenden) bei Brüttemperatur zu beobachtenden Object, innerhalb des Brütraumes, das Ocularende des Tubus aber, femer die Mikrometerschraube ausserhalb des Brütraumes befindlich sind. Solche Brütapparate gestatten die continuirliche Beobachtung lebender Objecte, z. B. Culturen im hängenden Tropfen (cf. oben p. 155) etc., bei Brüt- temperatur. Unter den für derartige Zwecke constnürten Vorrich- tungen möchte ich speciell die von Friedrich'-) angegebene „Heiz- *) Die früher gebräuchlichen Brütschränke aus verbleitem Eisenblech sind nicht zu empfehlen. Sie rosten sehr leicht und erfordern dann fortwährend Reparaturen. '-) Arb. a. d. Kais. Ges.-Amte. Bd. S. 1S92. V. Allgemeine Methodik der Bakterienzüchtung. 169 vorriclitiing des Mikroskopes zu bakteriologischen Untersuchungen'' empfehlen. Der Thermoregulator kann nach verschiedenen Principien construirt sein. Am zuverlässigsten sind und am genauesten wirken die electrischen Thermoregulatoren. Bei diesen steht innerhalb des Wassermantels des Thermostaten ein sogenanntes Contactthermo- meter, d. h. ein Quecksilberthermometer, dessen Quecksilbersäule bei der Erreichung einer bestimmten, bei jedem einzelnen Instrumente von dem Verfertiger ein für alle Mal fest eingestellten, Temperatur mit einem Platindraht in Contact tritt. Dadurch wird dann ein galva- nischer Strom geschlossen, welcher seinerseits einen Electromagneten in Thätigkeit setzt, der die Gaszufuhr zur Heizflamme des Thermo- staten absperrt oder vielmehr auf ein Minimum reducii't. Wenn dann der Wassermantel sich wieder unter die genannte Temperatur abgekühlt hat, so wird der Contact aufgehoben, der Electromagnet tritt ausser Thätigkeit, die Heizflamme erlangt ihre ft'ühere Grösse u. s. f. Mit Hülfe der electrischen Thermoregulatoren kann man die Brütschrank- temperaturen bis auf Zehntel Grade genau einstellen. Weniger strengen Anforderungen, aber immerhin den meisten Bedürfnissen des bakteriologischen Laboratoriums, genügen die, im Principe von Bunsen und Lothar Meyer stammenden, Thermo- regulatoren, bei welchen der Gaszufluss zur Heizflamme bei Erreichung der gewünschten Temperatur durch Quecksilber abgesperrt mrd. Diese Regulatoren sind — im Gegensatz zu den electrischen — vom Gasdruck abhängig: sie lassen bei höherem Gasdruck mehr Leuchtgas durch als bei niedrigerem. Ganz besonders möchte ich das von H. Rohrbeck^) verfertigte Modell empfehlen. Dasselbe besteht aus einem starkwandigen , c. 14 mm weiten, c. 34 cm langen, vertikal stehenden Glasrohr, welches unten geschlossen und in der Mitte durch eine horizontale gläserne Scheidewand abgetheilt ist, die central eine enge, nach unten sich in ein offenes Glasrohr fortsetzende Oeffnung besitzt. Der Raum unterhalb der Scheidewand ist beinahe vollständig mit Quecksilber angefüllt, welches durch das erwähnte Glasrohr in den oberen Raum gelangen kann. Auf dem unteren Quecksilberhori- zont schwimmen mehrere Tropfen Aether. Der ganze Apparat steht in dem auf bestimmte Temperatur zu erwärmenden Wassermantel des Thermostaten. Je mehr mm durch die Elanime das Wasser erhitzt wird, desto mehr dehnen sich die Aetherdämpfe aus; dabei wird das Quecksilber mehr und mehr aus dem unteren Räume in den oberen ') Berlin N.W., Karlstrasse 24. J70 ^- Allgemeines. Raimi liinaiifgedrückt. Das Leuchtgas tritt mm in den oberen Eaiun hinein durch ein vertikal stehendes, dünnes, eisernes, in einer Stopf- büchse verschiebbares Rohr, welches (in verstellbarer Höhe) über dem oberen Quecksilberhorizonte mündet. Es tritt aus, um zu der Flamme zu gelangen, seitlich neben dem eisernen Eohre aus der Wand des Instrumentes. Erreicht nun mit zunehmender Erwärmung das obere QuecksilbeiTiiveau das Ende des eisernen Rohres, so wird die Oefl&iung desselben verschlossen, und die Flamme würde sofort verlöschen, wenn nicht ein feiner vertikaler Schlitz in dem Rohre noch ein wenig Gas durchtreten liese. Die Flamme wird also nur erheblich reducirt. Hat sich dann das Wasser wieder etwas abgekühlt, so tritt das Quecksilber wieder zurück, lässt das Gas wieder voll ausströmen u. s. f. Da das eiserne Rohr verstellbar ist, so kann man den Apparat auf beliebige Temperaturen (natürlich in gewissen Grenzen) einstellen, die dann constant^) bleiben. Hat man keine Gasleitung und keinen Thermoregulator zur Ver- fügung, so kann man seinen Brütap parat sehr gut mit einer Petroleumlampe heizen, deren Flammenhöhe empirisch, der ge- wünschten Temperatur entsprechend, eingestellt wird. Koch ^j, welcher bei seinen ersten, grundlegenden Untersuchungen über Milzbrand sich dieser Methode bediente, empfiehlt dieselbe auf das Wärmste. Man hat neuerdings übrigens auch sehr exact arbeitende Wärmeregulatoren für Petroleumheizung hergestellt. Am Schlüsse dieses Kapitels seien noch einige Worte der Frage gewidmet, auf welche Weise am zweckmässigsten verfahren wird, wenn es sich darum handelt, Bakteriencultur en zu vernichten. In den Laboratorien werden die Gefässe, welche die zu vernichtenden Culturen enthalten, gewöhnlich zunächst in ^/^ßproc. Säuresublimat- lösung (cf. p. 132) gethan, in der sie eine Reihe von Tagen verbleiben. Man sorgt dabei selbstverständlich dafür, dass die Desinfectionsflüssig- keit alle Theile der Cultur auch wirklich trifft. In der Regel ^vii'd man auf diese Weise innerhalb weniger Tage das Bakterienmaterial vernichtet haben. Sicherer jedoch geht man in jedem Falle, wenn man sich auf die Wirkung der Sublimatlösung nicht verlässt, sondern die Vernichtung durch Hitze, d. h. durch Auskochen, bewirkt. Da wir pathogenes Material, welches eine halbstündige Erhitzung im strömen- ^) Die Temperaturschwankungen betragen bei Anwendung des beschriebenen Eegulators im Allgemeinen nicht über 0,5^ C. •-) F. Cohn's Beitr. z. Biol. d. Pfl. Bd. 2. 1S76. p. 282. V. Allgemeine Methodik der Bakterienzüchtnng. 171 den Wasserdampf oder ebenso langes Kochen unbeschädigt vertrüge, nicht kennen, so dürfte es das Zweckmässigste sein, die Vernichtung von Culturen pathogener Bakterien ganz im Allgemeinen dadurch zu bewirken, dass man die resp. Gefässe 30 Minuten lang in siedendes Wasser oder in den Dampftopf bringt. 4. Anhang: Die Methoden der bakteriologischen Luft-, Wasser- und Boden -Untersuchung und ihre Avichtigsten Ergebnisse. a. Luftiiutersiichung-. In der uns umgebenden Luft finden wir stets Keime von Mikro- organismen, Es finden sich da sowohl Bakterienkeime wie Keime von Schimmelpilzen und von Hefen. Dieselben gelangen dadurch in die Luft, dass sie von dem Substrate, auf welchem sie sich ent- wickelt haben, durch Luftströmungen entfernt werden. Natürlich kann dies nur geschehen, wenn die Cultur eingetrocknet ist. So lange der Nährboden und die Cultur feucht sind, ist gewöhnlich keine Möglich- keit vorhanden, dass sich Theilchen der Cultur in die Luft erheben. Die geringen Lebensansprüche vieler Bakterienarten bringen es nun mit sich, dass allenthalben in der Natur, wo etwas Feuchtigkeit vor- handen ist, Bakterien zu wachsen vermögen. Vertrocknet eine Bakterien- colonie, wird sie durch zufällige Berührungen zerkleinert, in Staub verwandelt, so genügt der geringste Luftstrom, die Stäubchen davon- zufahren, um sie an irgend welchem anderen Orte abzusetzen. Die für die Untersuchung der Luft auf Bakterien angegebenen Methoden siad sehr zahlreich. Will man nur qualitative Auf- schlüsse über die Keime haben, kommt es Einem nur darauf an, zu ermitteln, welchen Arten die in einer bestimmten Luft enthaltenen Keime angehören, so empfiehlt sich die zuerst von Koch^) geübte „Absitzmethode". Man bedeckt den Boden eines sterilisirten Glasschälchens mit geschmolzener Nährgelatine und lässt nach der Erstarrung der Gelatine das Schälchen offen an dem Orte stehen, dessen Luft man untersuchen will. Die Keime setzen sich dann auf der Gelatineoberfläche ab. Nach bestimmter Zeit wird dann das Schälchen geschlossen , und die Keime müssen sich nun oberflächlich auf der Gelatine entwickeln, sofern sie überhaupt fähig sind, auf diesem Nährboden und in Gegenwart des Luftsauerstoffs zu wachsen. Koch 1) Mitth. a. d. Kais. Ges.-Amte. Bd. 1. ISSl. p. 33. "172 A. Allgemeines. setzte die Schälclien auf den Grund eines cj-linderförmigen Glasgefässes und mit diesem erst der Luft aus. Die Luft innerhalb des Cylinders ist von den äusseren Luftströmungen mehr oder weniger unabhängig, und so konnten wenigstens einigermassen auch quantitativ vergleich- bare Kesultate zwischen den an verschiedenen Orten ausgeführten Untersuchungen erhalten werden. Als Nährboden zeigte sich Weizen- infusgelatine am zweckmässigsten. Eine Methode, welche bezüglich der Quantität der in einem bestimmten Luftvolumen enthaltenen Keime erheblich mehr leistete, wurde dann von W. Hesse ^) erfunden. Hesse saugt vermittels eines Aspirators das zu untersuchende Luftquantum durch ein horizontal liegendes, ca. 70 cm langes, 3,5 cm weites Glasrohr, dessen Innenwand mit Nährgelatine ausgekleidet ist. Die Keime setzen sich dabei aus der Luft auf der Gelatine ab. Xatm'gemäss muss die Geschwindigkeit des Luftstromes sich in gewissen Grenzen halten, weil sonst Keime aus der Röhre wieder austreten könnten, ohne sich auf der Gelatine abgesetzt zu haben. Ein bequemeres und leistungsfähigeres Verfahren der quanti- tativen Luft Untersuchung auf Mikroorganismenkeime wurde dann von Petri") ausgearbeitet. Das Verfahren ist wohl das beste der überhaupt existirenden. Petri saugt die Luft mit Hülfe einer Handluftpumpe, die einen m ihrem Volumen geaichten Kolben besitzt imd dm'ch eine Kurbel in Bewegung gesetzt wird, durch ein Sandfilter, in welchem die Keime zurückgehalten werden. Das mit den Keimen beladene Filter wird in ein „Petri"sches Schälchen" (cf. oben p. 156) gebracht, der Sand wird dann mit geschmolzener Xährgelatine vermischt und gründlich darin vertheilt. Die sich nach dem Erstarren der Gelatine entwickelnden Colonien können dann gezählt und weiter untersucht werden. Der Sand hat eine Kom- grösse von 0,25 — 0,5 mm imd wird vor der Verwendung ausgeglüht. Derselbe wird in zwei dm'ch kleine Drahtnetze gestützten Schichten von je 3 cm Länge und 1,5 — 1,8 cm Durchmesser in ein 8 — 9 cm langes Glasrohr eingebracht und in dieser Anordmmg zum Filtriren der Luft verwendet. Mcht mehr als 5 — 10 Liter Luft pro Minute werden durch das Filter gesaugt, so dass die Geschwindigkeft' des Luftstromes im Filter 0,7 m pro Secunde nicht übersteigt. Bei den einzelnen Bestimmungen werden 50 — 100 Liter Luft zur Unter- suchung filtrirt. 1) Mitth. a. d. Kais. aes.-Amte. Bd. 2. 1S84. -) Centralbl. f. Bakt. Bd. 2. 1SS7. Xo. 5—6. — Zeitscbr. f. Hyg. Bd. 3. ISST. V. Allgemeine Methodik der Bakterienzücbtung. 173 Petri bftt bei den zahlreichen Luftuntersuchungen, die er nach seiner Methode anstellte, und bei denen er stets Controluntersuchungen nach der Absitzmethode unternahm, gefunden, dass bei der Filtrir- methode relativ mehr Pilzsporen, bei der Absitzmethode relativ mehr Bakterienkeime gefunden werden. Jedenfalls ist hierfür das ver- schiedene specifische Gewicht der Keime verantwortlich zu machen. Die Pilzsporen sind nämlich sehr leicht, die bakterientragenden Stäubchen specifisch viel schwerer; die letzteren werden sich also leichter zu Boden senken als die ersteren. Ein weiterer interessanter Befund, der sich aus den Petri' sehen Versuchen ergeben hat, ist der, dass die an einem und demselben Stäubchen anklebenden Bak- terienkeime relativ selten verschiedenen Arten zugehören. Mehr als drei Species entwickelten sich niemals an der Absatzstelle eines ein- zelnen Luftstäubchens. In Franki'eich bedient man sich für Luftuntersuchungen immer noch des (fi-üher allgemein üblichen) flüssigen Nährbodens. Miquel, welcher im Observatorium des Montsouris zu Paris fortlaufende Luft- untersuchungen anstellt, saugt den Luftstrom durch sterilisirtes Wasser und vertheilt nachher das mit den Keimen beladene Wasser zu gleichen Portionen in eine grössere Anzahl von Gefässen mit steriler Bouillon. Von diesen muss dann mindestens ein Drittel ohne Entwickelung von Organismen bleiben, d. h. sich als keimfi-ei herausstellen. Man darf dann annehmen, dass in den Gefässen, in denen Entwickelung zu Stande kommt, diese nur von einem einzigen Keime ausging, und hat damit die Anzahl der in der durchgesaugten Menge Luft enthalten gewesenen Keime. Die Mkroorganismen , welche bei Luftuntersuchungen gefunden werden , sind erstens die verschiedenartigsten Schimmelpilze , ferner eine Anzahl Hefen, endlich Bakterien. ') Die Mehrzahl der Bakterien- keüne gehört den Mikrococcen an; speciell finden sich ganz regel- mässig eine Anzahl Sarcinearten. Die Colonien verflüssigen ihrer grossen Mehrzahl nach die Gelatine nicht. Viele ehr o mö- gen e Arten (cf. p. 46) finden sich. Die meisten Keime gehören sapro- phytisehen Arten an; es sind aber hier und da auch pathogene Keime gefunden worden. Ln Allgemeinen zeigen die auf den Luftplatten sieh entwickelnden Bakterieneolonien ein sehr langsames Wachsthum, offenbar aus dem ^) Welz (Zeitschr. f. Hyg. Bd. 11. 1891) bat eine gTÖssere Eeihe von Mikro- organismenarten, die er in der Luft (in Freiburg) fand, übersicbtlicb , in Tabellen- form, beschrieben. 174 -A-- Allgemeines. Grunde, weil die an den Luftstäubclien angetrockneten Bakterienzellen, aus denen die Colonien hervorgehen, gewöhnlich bereits längere Zeit der Lehensthätigkeit entzogen waren und die zu einer kräftigen Ver- mehrung nothwendige Energie erst wieder gewinnen müssen. Je mehr Staub in der Luft enthalten ist, desto mehr Keime findet man bei der Untersuchung. „Die Zahl der in der fi-eien Atmo- sphäre geftmdenen Keime schwankt, zwischen 100 — 500 — 1000 und mehr pro 1 cbm; im Mttel 500 — 1000 Keime, und darunter 100 bis 200 Bakterien" (Flügge^)). Fast keimfi-ei oder auch vollständig keimfrei hat sich die Luft draussen auf hoher See in weiter Ent- fernung vom Lande ei*wiesen. Auch auf den Spitzen schneebedeckter Berge ist die Luft sehr arm an Keimen. 1). Wasser unter suchung. Um den Bakteriengehalt eines bestimmten Wassers festzustellen, verfährt man nach Koch 's ^) ursprünglichem Vorgang so, dass man eine bestimmte Menge des Wassers (gewöhnhch nimmt man 1 ccm oder '/2 com oder auch [zur gegenseitigen Controle der Versuche] beides) mit sterilisirter Pipette in ein Röhrchen mit geschmolzener Nährgelatine •^) vertheilt und die Gelatine dann auf eine sterile Platte^) ausgiesst. Nach dem ErstaiTen der Gelatine ent\Aickeln sich dann die ^) Grundriss d. Hygiene. 3. Auflage. Leipzig. 1S94. p. 148. -) Mitth. a. d. Kais. Ges.-Amte Bd. 1. 1881. p. 36. ^) Die Nährgelatine muss zum Zwecke der Wasseruntersuchung eine be- stimmte chemische Eeaction besitzen; denn es hat sich gezeigt, dass Nähr- gelatinen, welche in dieser Beziehung unter einander diiferiren, aus einem bestimmten Volumen eines und desselben Wassers verschieden viel Colonien aufgehen lassen. Am günstigsten für die Entwickelung der Wasserbakterien hat sich im Allgemeinen eine Nährgelatine erwiesen, welche einen Gehalt von etwa 0,15''/o Natriumcarbonat (dem neutralen Nährboden zugesetzt) hat. Jlit einer solchen Nährgelatine erhält man im Allgemeinen das Maximimi an Colonien aus einer bestimmten Wasserprobe. Jedoch scheinen sich verschiedene Wässer in dieser Beziehung etwas verschieden zu ver- halten (cf. Eeinsch, Centralbl. f. Bakt. Bd. 10. 1891. No. 13; Bd. 16. 1894. p. 883). — B. Fischer (Centralbl. f. Bakt. Bd. 15. 1894. p. 659) imdet, dass manche Meeresbakterien erhebhch besser als auf den gewöhnlichen Nährböden auf solchen Nährböden wachsen, die mit Seewasser hergestellt sind. Zur Bereitung des Fleisch Wassers , als Constituens der Nährböden, gebraucht Fischer hier kein Rindfleisch, sondern das Fleisch grüner Heringe. ^) Es empfiehlt sich, zu diesen Untersuchungen stets Platten, nicht Pe tri 'sehe Schälchen, zu nehmen. Nur auf Platten zeigt nach dem Erstarren die Cultur- gelatine überall gleichmässige Dicke; das Letztere ist aber nothwendig, wenn man (siehe oben im Text weiter) , zum Behufe der Zählimg der entwickelten Colonien, aus einem Theile der Platte auf die ganze Platte schliessen will. V. Allgemeine Methodik der Bakterienzüclitung. 175 emgesäeten Keime in isolii-ten Colonien, deren Anzahl in der weiterhin zu besprechenden Weise festgestellt werden kann. Ist das zu unter- suchende Wasser ausserordentlich reich an entwickelungsfähigen Keimen, so ist es zur Erzielung brauchbarer Culturplatten nothwendig, das- selbe auf das 10 bis 20 fache Volumen mit sterilisirtem Wasser zu verdünnen. Die Feststellimg der Anzahl der auf der Platte zur Entwickelung gekommenen Colonien geschieht am besten mit Hülfe eines zu diesem Zwecke (von WolffhügelJ construirten Zählapparates. Der letztere besteht aus einer horizontalen schwarzen Tafel, auf welche die Culturplatte aufgelegt wird. In einiger Entfernung darüber wird eine Glasscheibe gelegt, in welche ein Gitterwerk von gleich grossen Quadraten mit dem Diamanten eingerissen ist. Auf dieser Platte steht eine dreibeinige Loupe, durch die hindurch man zugleich das Gitterwerk und die Colonien sieht. ^) Man bestimmt nun für eine Reihe von Quadraten durch directe Zählung die Anzahl der in jedem liegenden Colonien, nimmt daraus das Mittel und multiplicii't die ge- wonnene Zahl mit der Anzahl der Quadrate, die auf die ganze Platte kommen. Ist die Zahl der auf der Platte zur Entwickelung gekommenen Colonien sehr gross, oder, was dasselbe sagt, hegen die Colonien sehr dicht neben einander, so gelingt es häufig gar nicht die Anzahl der- selben mit Hülfe des beschriebenen Zählapparates zu bestimmen. In solchen Fällen kann man die Zählung sehr bequem unter de m Mikroskope^) vornehmen. Zu dem Zwecke bestimmt man sich zunächst, unter Zuhülfenahme eines Objectmikrometers, für sein In- sti-ument — und zwar für ein bestimmtes, schwaches System, für ein bestimmtes Ocular und für eine bestimmte Tubuslänge — ein für alle Mal den Flächeninhalt des Gesichtsfeldes. Man bringt dann die Cultui-platte unter diesen Bedingungen unter das Mikroskop und zählt ') Durch Mio (Hyg. Eundschau. 1S94. p. 294) ist der Wolffhügel'sche Apparat in sehr zweckmässiger Weise dahin modificirt worden, dass das Gitter- werk auf der unteren, schwarzen Tafel angebracht ist, und dass die obere Glasscheibe nur dazu benutzt wird, die Stehloupe zu tragen. Die Wirkung der ParaUaxe, welche bei dem ursprünglichen Wolffhü gel 'sehen Apparate — in Folge der ziemüch be- deutenden Differenz der Entfernungen , die die Culturplatte einerseits und die Mess- platte andererseits vom Auge des Untersuchers haben — eine recht erhebliche war und gelegentlich zu mehr oder weniger fehlerhaften Auszählungen Veranlassung geben musste, ist bei dem Mio 'sehen Apparate, der die Cultur- und die Messplatte nahe an einander bringt, auf ein Minimum reducirt. -) cf. Bu ebner, Longard und Ei edlin (Centralbl. f. Bakt. Bd. 2. 1887. p. 3). 176 ^- Allgemeines. eine gTÖssere Reihe (20 bis 40) beliebig ausgewählter Gesichtsfelder bezüglich der Colonienanzahl aus; selbstverständlich berücksichtigt man dabei jedesmal (unter Benutzung des groben Tubustriebes) die Gelatine- schicht in ihrer gesammten Dicke. Aus der sich daraus ergebenden Durchschnittszahl und aus dem Yerhältniss der Grösse der ganzen Gelatineplatte zur Grösse des einzelnen Gesichtsfeldes lässt sich dann leicht die Anzahl der Colonien berechnen, welche auf die ganze Platte kommen. Unter Umständen, nämhch wenn die Anzahl der Colonien ganz ausserordentlich gTOss ist, führt auch dieses Verfahren noch nicht ohne Weiteres zum Ziele ; es kommen dann nämüch so zahlreiche Colonien auf jedes Gesichtsfeld, dass ihre dii'ecte Auszählung uimiöglich wird. Dann hilft man sich in der Weise, dass man jedesmal mu' einen bestimmten, in seiner Ausdehnimg vorher (mit Hülfe des Objectmikro- meters) ausgemessenen, Theil des Gesichtsfeldes auszählt. Diesen Theil des Gesichtsfeldes grenzt man durch Linien ab, die auf einem Glasplättchen angebracht sind, welches auf das Diaphragma des Oculars gelegt wird. Bei der mikroskopischen Beobachtung sieht man die Linien dieses „Ocular-Netzmikrometers" ) gleichzeitig mit den mikroskopisch betrachteten Colonien. Ausgezeichnet eignen sich für diesen Zweck auch die von Ehrlich angegebenen, in das Ocular einzulegenden Blenden, -) welche (verschieden gTosse) quadi'atische Oeff- nungen besitzen und das abzuzählende Gesichtsfeld ganz beliebig ein- zuschränken gestatten. ■^) Zum Zwecke der bakteriologischen Untersuchung wird das Wasser am Orte der Entnahme in sterile Gefässe (z. B. Erlenme}- er'sche Kölbchen) eingefüllt, die mit sterilisirtem Watteverschluss versehen und dann unverzüglich in das Laboratorium gebracht werden. Die entnommenen Proben sollen möglichst sofort in der oben an- gegebenen Weise zur Einsaat in Gelatine kommen. Das Letztere soll jedenfalls nicht später als etwa eine Stunde nach der Entnahme ge- schehen, weil die veränderten Bedingungen eine Veränderung des Bakteriengehaltes sowohl hinsichtlich der absoluten Quantität der Keime wie hinsichtlich der relativen Menge der verschiedenartigen Keime zur Folge haben. Unmittelbar vor der Einsaat in die Gelatine ist das zu untersuchende Wasser umzuschüttein, damit etwa zu Boden gegangene ^) Die aiif p. 48 genannten mikroskoj^iscben Firmen führen derartige In- strumente. ") Von Carl Zeiss, Jena, zu beziehen. ^) Dass — namentlich bei dicht besäeten Platten — die mikroskopische Zählung im Allgemeinen richtigere Werthe giebt als die Loupenzählung , hat M. Neisser (Zeitschr. f. Hyg. Bd. 20. 1895) nachgewiesen. V. Allgemeine Meth(xUk der Bakterienziichtung. 177 Keime aufgerührt werden und eine gleiclimässige Vertheilung der Keime in der Probe erzielt wird.^) Die im Wasser gefundenen Bakterien gehören meist der Gruppe der Bacillen an.-) Vorwiegend kommen verflüssigende Arten zur Ent- wickelung. Man nennt die Bakterien, welche sich mit Vorliebe im [i'luss-, See-, Meer- •^)] Wasser aufzuhalten pflegen, „Wasserbakte- r i e n ". Pathogene Bedeutung kommt denselben nicht zu. P a t h o g e n e Arten sind selten im Wasser gefunden worden. Die wichtigsten hierhergehörigen Befunde sind die Befunde von Choleravibrionen in verschiedenen Wässern bei Gelegenheit von Choleraepidemien, ^) ferner zahlreiche Einzelbefunde von T y p h u s 1) a c i 1 1 e n in dem Wasser durch Typhusdejectionen verunreinigter Brunnen. Im Allgemeinen gehen pathogene Bakterien, die in gewöhn- liches Wasser eingebracht werden, in kurzer Zeit zu Grunde; sie werden von den Wasserbakterien überwuchert. Jedoch scheint in dieser Beziehung die Temperatur des Wassers eine grosse Rolle zu spielen; höhere Temperatur (hohe Sommertemperatur) scheint begünstigend auf die Vermehrung pathogener Bakterien zu wirken.'^) ^) Die Sediinentirung spielt, wie hier in unseren Gefässen, so auch in der Natur eine wichtige EoUe bezüglich des Bakteriengehaltes des Wassers. Grosse Wasserbecken mit langsamer Strömung, welche zunächst ein bakterienreiches Wasser aufnehmen , wirken stets als Kläranlagen. Sie lassen in sehr kurzer Zeit den aller- grössten Theil der suspendirten Bakterienzellen zu Boden gehen ; die letzteren häufen sich in Form einer zusammenhängenden schleimigen Masse auf dem Grunde an. (cf. auch Eubner, Arch. f. Hyg. Bd. 11. 1890.) -) Eine Eeihe von Bacillenarten, die im Wasser regelmässig vorkommen, haben G. C. Frankland nnd P. F. Fr an kl and (Zeitschr. f. Hyg. Bd. 6. 1889) be- schrieben. Tils (ebenda Bd. 9. 1890) hat eine grössere Eeihe von Bakterienarten, die er im (Freiburger) Leitungswasser fand, übersichtlich, in Tabellenform, beschrieben. Lustig (Diagnostik der Bakterien des Wassers. Jena und Turin. 2. Aufl. 1893. 128 Seiten) hat sich die Mühe genommen, die in der Literatur zerstreuten Angaben über Wasserbakterien zu sammeln und tabellarisch zu ordnen. >*) Nach B. Fischer (Centralbl. f. Bakt. Bd. 15. 1S94. p. 0(34, 665) zeigen die im Meerwasser vorkommenden Bakterienarten (,,Halibakterien") sämmt- lich Eigenbewegung; regelmässig kommen bei den einzelnen Arten schraubig ge- krümmte Formen vor (Aehnlichkeit mit Kommabacillen) ; nach Gram sind die Meeresbakterien nicht färbbar; viele von ihnen wachsen schon bei 0" C. ^) Der erste derartige -Befund stammt von E. Koch. Koch fand die Cholera- vibrionen in einem Tank in der Nähe von Calcutta. (K o c h ' s Bericht aus Calcutta vom 4. März 1884. — Deutsche med. Wochenschr. 1884. p. 222.) ') cf. Hueppe, Berl. klin. Wochenschr. 1893. p. HO. — Auch eine Zu- nahme des Kochsalzgehaltes im Wasser wirkt begünstigend auf die Vermehrung pathogener Bakterien. Günther, Bakteriologie. 4. Auflage. 12 178 A-. Allgemeines. In sterilisirtem Wasser können sich patliogene Arten lange Zeit lebend erhalten. Bezüglich des Keimreichthums verschiedener Wässer macht Flügge ^J folgende Angaben: „In der Regel beobachtet man in reinem Leitnngs- nnd Quellwasser 2 — 50 Bakterien in 1 ccm, in reinen Pumpbrunnen 100 — 200 — 500, in filtrirtem Flusswasser 50 — 200, in unfiltrirtem Wasser rein gehaltener Flüsse 6000 — 2000 0, in ver- unreinigten Brunnen bis zu 100 000, ebensoviel bei Störung des Filter- betriebes in Flusswasserleitungen; im Kanalwasser oder in stark ver- unreinigten Flussläufen 2 — 40 Millionen Bakterien in 1 ccm." In grossen Wasserbecken , constatirte K a r 1 i n s k i -) eine Abnahme der Bakterienzahl nach der Tiefe zu. H. Büchner-^) hat den Nachweis geführt, dass das Licht (namentlich das directe Sonnenlicht) auf im Wasser suspendirte Bakterien einen gewaltig schädigenden Einfluss ausübt. Selbstverständlich ist in hygienischer Beziehung die Frage, wie viele Keime in einem Cubikcentimeter eines bestimmten Wassers enthalten sind, von ganz untergeordneter Bedeutung gegenüber der Frage, av eichen Arten die vorhandenen Keime angehören, speciell ob p a t h g e n e Keime in dem zu untersuchenden Wasser vorhanden sind oder nicht. TJm die letztere Frage im Einzelfalle zu entscheiden, ging man früher ausschliesslich so vor, dass man eine Quantität des Wassers mit Kährgelatine vermischte, zur Platte ausgoss, und dass man dann unter den entwickelten Colonien auf pathogene (speciell kommen hier Cholera- und Typhusbakterien in Betracht) fahndete. Die Feststellung vereinzelter Colonien pathogener Bakterien auf der Platte neben einer grossen Ueberzahl nicht pathogener Colonien hat aber sehr grosse Schwierigkeiten, und nur in seltenen Fällen hat die Plattenaussaat zur Feststellung pathogener Keime in dem untersuchten Wasser geführt (cf. p. 177). Die sichere Beantwortung der Frage, ob ein bestimmtes Wasser gesundheitsschädlich ist oder nicht, ist also mit Hülfe der geschilderten Methode kaum zu geben : und auch die Untersuchung der chemischen Beschaffenheit des Wassers kann diese Frage nicht ausreichend beantworten, da die Krankheitserreger nicht todte chemische Körper, sondern lebende Wesen sind. Was die Untersuchung speciell auf C h o 1 e r a b a k t e r i e n angeht, ') Grundriss d. Hygiene. .3. Auflage. Leipzig. 1894. p. 192. ^) Centralbl. f. Bakt. Bd. 12. 1892. No. 7/8. «) Centralbl. f. Bakt. Bd. 11. 1892. No. 25; Arcb. f. Hyg. Bd. 17. 1893. p. 202. y. Allgemeine Methodik der Balvterienzücbtung. 179 SO sind in den letzten Jahren von verschiedenen Seiten \) yerl)esserungen des Verfahrens der bakteriologischen Wasseruntersuchung- angegeben worden, die darauf beruhen, dass man dem zu prüfenden Wasser zu- nächst bestimmte für das Wachsthmn der Cholerabakterien günstige Zusätze giebt und dasselbe dann eine gewisse Zeit bei einer für die Cholerabakterien sehr günstigen, für die Wasserbakterien weniger günstigen Temperatur stehen lässt. Man erzielt so bei dem Vorhanden- sein von Cholerakeimen in dem Wasser eine Vermehrung derselben; und eine dann folgende Plattenaussaat bietet viel mehr Chancen für das Auffinden der Cholerakeime, als es die Plattenaussaat des ur- sprünglichen Wassers gethan hätte. Mit diesem verbesserten Verfahren hat z.B. Koch während der Winterepidemien 1892/93 in einer Reihe von Fällen Cholerabacillen im Wasser nachgewiesen. Für die Unter- suchung des Wassers auf T y p h u s b a c i 1 1 e n haben ^vir derartige ver- besserte Methoden bis jetzt nicht. Hier sind wir auf die primäre Plattenuntersuchung des ursprünglichen Wassers angewiesen. Xoch in anderer Hinsicht aber ist die bakteriologische Wasser- untersuchung von grosser Bedeutung für die Hygiene. Wenn es sich darum handelt, ein gi'össeres Gemeinwesen mit einer centralen Wasser- versorgung zu versehen , so sind wir , Avenn nicht Q u e 1 1 w a s s e r oder das unter normalen Verhältnissen keimfreie (cf. unten p. 1 82) Grundwasser in ausgiebigem Masse zm' Verfügung stehen, darauf angewiesen, Oberflächenwasser (Fluss-, Seewasser) zu nehmen. Das Oberflächenwasser ist nun (cf. oben p. 178) schon an und für sich fast ausnahmslos reich an organischen Keimen; und zu Zeiten von Cholera- oder Tj-phusepidemien liegt die Gefahr ausserordentlich nahe, dass in dieses Wasser hinein die entsprechenden Krankheits- keime gelangen und dann durch die Wasserleitung überall hin ver- schleppt werden. Es ist also ein hygienisches Gebot ersten Ranges, dass das für die Wasserversorgung bestimmte Oberflächenwasser zu- nächst von den in ihm eventuell vorhandenen Infectionskeimen befreit werde. Das kann aber nur so geschehen, dass man die im Wasser vorhandenen organischen Keime überhaupt entfernt. Das beste Mittel, Wasser von organischen Keimen zu l)efreien, ist selbstverständlich das Kochen desselben resp. das Sterilisiren durch Erhitzung. Dies lässt sich aber nur im Ivleinen ausführen. Soll im Grossen möglichst keim- freies Wasser hergestellt werden, so muss das Wasser durch Filtration von den Keimen befreit werden. Am besten geschieht dies durch die, ^) Näheres hiei-über siehe weiter hinten hei Gelegenheit der Besprechung des Choleravibrio. 12* 180 A. Allgemeines. in vielen Städten bereits eingeführte, San dfil trat i(3 n. i) Die bakteriologische Prüfung des Wassers vor und nach der Filtration gewährt uns nun ein unfehlbares, durch nichts Anderes zu ersetzendes ilittel , den genannten Filtrationsprocess zu controliren. Hierin liegt mit der Hauptwerth der bakterio- logischen Wasseruntersuchung. - ) Bei der künstlichen Filtration des Wassers durch Sand werden übrigens nicht alle Keime, sondern nur der allergTösste Theil der- selben, aus dem Rohwasser entfernt. Die in dem filtrirten Wasser vorhandenen Keime stammen zum allergrössten Theile nicht aus dem Rohwasser, sondern aus den unteren (Stein-, Kies- und Sand-) Schichten der Sandfilter, welche letzteren sich im Laufe der Zeit mit Bakterien- vegetationen überziehen. Diese Filterbakterien sind harmlose Wasserbewohner ohne pathogene Bedeutung, Kleinfilter, d. h. Wasserfilter für den Hausgebrauch, sind im Allgemeinen nicht zu empfehlen. Wir kennen keine einzige Con- struction, die für längere Zeit mit Sicherheit keimfreies Wasser fördert. Bezüglich der Art und Weise, wie die in dem filtrirten Wasser auf- tretenden Keime dahinein gelangen, ist sehr wichtig die Thatsache, dass ein a priori, d. h. zu Anfang der Benutzung, durchaus keim- dichtes Filter^) gewöhnlich im Laufe der Benutzung, oft schon binnen wenigen Tagen, von Bakterien durchwachsen wii'd: die Bakterien- ^) Indem bezüglich genauerer Daten über Sandfiltration auf die Arbeiten von Plagge und Proskauer (Zeitschr. f. Hyg. Bd. 2. 1887), C. Fränkel und Piefke (ebenda Bd. S. 1S90), E. Koch (ebenda Bd. 14. 1893), Piefke (ebenda Bd. 16. 1894) verwiesen wird, soll hier nur auf folgende für die Sand- filtration wichtigen Punkte aufmerksam gemacht werden: Das eigentlich Fil- trirende in den Sandfiltem ist nicht der Sand selbst, sondern die Schlammdecke, welche sich durch Sedimentirung der in dem Wasser suspendirten Bestandtheile auf der Sandoberfläche ansammelt. Es kommt darauf an, dass diese Schlammschicht sich zunächst regelrecht bildet. Nach ihrer Bildung kann die Filtration vor sich gehen. Die Filtrationsgeschwindigkeit soll über ein Maximum von 100 mm in der Stunde nicht hinausgehen. Die sich allmählich verdickende und damit dem AVa.sser immer mehr Widerstand bietende Schlamm schiebt soll zu rechter Zeit entfernt wer- den. Die Sandschicht soll stets mindestens 30 cm hoch bleiben. Jedes einzelne Filter eines Filterwerks soll mit einer Einrichtung versehen sein, die es gestattet, das filtrirte Wasser zu entnehmen, um es bakteriologisch auf seinen Keimgehalt zu untersuchen. Die Untersuchung hat möglichst oft zu geschehen. Es muss an jedem Filter eine Emrichtung vorhanden sein, die es ermöglicht, das ungenügend gereinigte Wasser zu entfernen, ohne dass es sich mit dem gut filtrirten Wasser mischt. -) cf. R. Koch, 10. Internat, med. Congr. Berlin 1890. Verhandl. Bd. 1. p. 44. ^) Hierhin gehören die Pa ste ur-Ch am berl and 'sehen Porcellanfilter (Por- ceUankerzen) , ferner die aus gebrannter Infusorienerde bestehenden sogenannten „Berkefeld" -Filter und andere. V. Allgemeine Methodik der Bakterienzüchtung. 181 Zellen Ijilden Ansiedelungen in den Porenräumen des Filters, durch- wucliern diese und gelangen so bald in das filtrirte Wasser hinein. Dabei braucht das Filter von seiner Bakteriendichtigkeit durchaus gar nichts einzubüssen: wird ein solches Filter wieder zweckmässig ge- reinigt und sterilisirt, so kann ein zunächst vollständig normal fünc- tionirendes Filter Aviedererhalten werden. lieber die filtrirende Wirkung des Erdbodens vergl. den nächsten Abschnitt (p. 182). c. Bodenuutersucliuiig. Um den Gehalt einer bestimmten Bodenprobe an Mikroorganismen zu untersuchen, verfährt man nach C. Fraenkel,^) dem wir eine der besten Arbeiten über diesen Gegenstand verdanken, so. dass man eine abgemessene Quantität des Bodenmaterials in ein Reagenzröhrchen mit geschmolzener Gelatine einfüllt, das Material dann gründüch in der Gelatine vertheilt und die Gelatine nachher an den Wandungen des Eöhrchens nach der Esmarch'schen (cf. p. 156) Methode ausrollt. 8o behält man das gesammte Material innerhalb des Eöhrchens, wäh- rend l)eini Ausgiessen der Gelatine auf eine Platte etc. ein Theil der Keime, an Erdbröckelchen anhaftend, im Glase zurückbleiben würde, und das Eesultat dadurch ein unsicheres werden würde. Fig. 26 auf Taf. V zeigt ein solches Eöhrchen, welches mit Gartenerde beschickt wurde (cf. oben p. 157). C. Fraenkel hat ein besonderes, sinn- reich eingerichtetes Bohrinstrument -) construirt, welches gestattet, Erd- proben aus beüebiger Tiefe ohne jede Verunreinigung zur Untersuchung heraufzuholen. Uebrigens muss (me bei Wasseruntersuchungen [p. 176]) auch bei Bodenuntersuchungen die Einsaat des Materials in die Gelatine mög- lichst bald nach der Entnahme desselben aus dem Boden geschehen, da sonst in Folge der veränderten Bedingungen (veränderte Temperatur, veränderte Zusammensetzmig der umgebenden Luft) eine uncontrolir- bare Vermehrung einzelner Mikroorganismenarten in dem Materiale selbst stattfindet. Bei den Bodenuntersuchungen hat sich nun ergeben, dass die oberen Schichten des Bodens überall , sowohl bei bebautem wie bei jungfräulichem Terrain, sehr keimreich sind. ,.Es finden sich im Durchschnitt selbst im sogenannten jungfräulichen, unbebauten Boden ca. 100 000 Keime in 1 ccm Boden, oft noch erheblich mehr" ') C. Fraenkel, Zeitschr. f. Hyg. Bd. 2. ISS" -) 1. c p. 535. 182 -•^- Allgemeines. (Flügge).^) Dieser Keiim-eichthiun erleidet nach der Tiefe zu eine Abnahme ; und zwar ist diese Ahnahme eine allmähliche bis etwa zur Tiefe von l^^ m. Dort wd die Abnahme plötzlich eine sehr rapide, so dass schon wenige Decimeter tiefer der Boden häufig völlig keimfrei angetroffen wird. Die Schicht des Grundwassers ist ge- wöhnlich vollständig keimfrei. Die geschilderte Vertheilung der Bakterienkeime im Boden ist so zu deuten, dass die Keime von aussen, durch die Luft oder mit Dungstoflfen etc., auf die Oberfläche und in die obersten Schichten des Bodens gelangen, dass sie dann, eventuell nachdem in dem einen oder anderen Falle eine Vermehrung statt- gefunden hat, mit dem in den Boden einsickernden Regen- etc. Wasser mehr in die Tiefe gespült werden. Während aber das Wasser seinen Weg durch den porösen Boden hindurch bis in das Grundwasser hin- ein weiter findet, bleiben die Bakterien als feste Theile z\Aischen den Partikelchen des Bodens hängen, so dass also, je nach der Boden- beschaffenheit in wechselnder Tiefe, das Wasser der vorher beigemischten Bakterien entledigt ist. Es findet hier dieselbe filtrirende Wir- kung der E r d p a r t i k e 1 c h e n statt, wie wir sie bei den Sandfiltern der Wasserleitung (cf. oben p. 180) künstlich herstellen. Xur ist die natürliche filtrirende Wirkung des Bodens der filtiirenden Wirkung der künstlichen Sandfilter ganz ausserordenthch überlegen, und zwar ein- fach aus dem Grunde, weil die Filtrationsgesch\Aindigkeit im Boden eine so sehr viel langsamere ist als in den künstlichen Filtern. Da das Grundwasser in der Regel keimfi-ei ist, so liefern die Röhrenbrunnen dann wirklich keimfreies Wasser, wenn das Rohr selbst frei von Keimen ist. Durch einfaches Aus- bürsten des Brunnenrohres gelang es C. Fraenkel'-) in einem be- stimmten Falle, das Brunnenwasser, welches vorher recht keimreich gewesen war, für eine Reihe von Tagen völlig steril zu machen. Die Kesselbrunnen, welche Verunreinigungen von aussen fortgesetzt preisgegeben sind, lassen sich natürlich nicht in dieser Weise säubern. Die im Boden vorkommenden Bakterienarten ■^) gehören meist zu den Bacillen. Vorwiegend fand Koch*) bei seinen ersten orientirenden Untersuchungen den Heubacillus und den „würz eiförmigen-' Bacillus. Beide sind nicht pathogen. Colonien des „wurzeiförmigen" ') Grundriss der Hygiene. 3. Auflage. Leipzig. 1S94. p. 17.5. -) Zeitschr. f. Hyg.' Bd. 6. 18S9. ") FüUes (Zeitschr. f. Hyg. Bd. 10. 1891) hat eine grössere Eeihe von Bakterienarten, welche er im (Freiburger) Boden fand, übersichtlich, in Tabellenforni, beschrieben. *) Jlitth. a. d. Kais. Ges.-Amter Bd. 1. Ibbl. p. 35. V. Allgemeine Methodik der Bakterienzüchtung. 183 Bacillus sieht man übrigens auch in dem Taf. V, Fig. 26, dargestellten, mit Gartenerde angelegten Culturrohrchen. Die Colonien sind durch die feinen von ihrer Peripherie ausgehenden Ausläufer kenntlich. Den „wurzeiförmigen" Bacillus, auch „Erdebacillus" genannt, findet man fest ausnahmslos in jeder Bodenprobe. Von pathogenen Bakterien kommt in den oberen Culturschichten des Erdbodens weit verbreitet der Bacillus des malignen Oedems vor (R. Koch')). Der- selbe wird in gedüngter Gartenerde fast stets gefimden. Hier kommt auch der Tetanusbacillus vor. Im Uebrigen gehen pathogene Bakterien, welche in den Boden eingebracht werden, in kürzerer oder längerer Frist zu Grunde. -) ') Ebenda p. 5(). ■-) cf. unter Anderem: C. Fraenkel, Zeitschr. f. Hyg. Bd. 2. ISST. p. 579 bis 581; E. v. Esmarch, ebenda Bd. 7. 1S89; Fe tri, Arb. a. d. Kais. Ges.- Amte. Bd. 7. 1891. B. Die Bakterien als Krankheitserreger. I. Einleitendes. V on einer ganzen Reihe von Bakterienarten hat man nach- gewiesen, dass ihnen die Fähigkeit zukommt, in den leidenden thieri- sehen Körper einzudringen und denselben zur Erkrankung zu bringen. Man hat sich das so vorzustellen, dass der lebende thierische Körper hierbei den Bakterien in ähnKcher AVeise zum Nährboden dient, wie dies sonst todtes organisches Substrat thut. In l)eiden Fällen Avachsen die Bakterien und vermehren sich auf Kosten des Nähr- bodens; in dem einen Falle wird das todte Nährmaterial dabei in bestimmter Weise verändert, in dem anderen Falle ist es die Sub- s t a n z des 1 e 1) e n d e n K ö r p e r s , welche d u r c h d a s B a k t e - rienwachsthum verändert wird. Die Veränderungen, welche der lebende Körper auf diese Weise erleidet, kommen in ihrer Ge- sammtheit als Erkrankung des Körpers zum Ausdruck; und man bezeichnet ganz im Allgemeinen solche Krankheiten, die durch die Vermehrung in die Körpersubstanz eingedrungener organischer Keime hervorgerufen werden, als ..Infectionskrankheiten". Das Ein- dringen der Keime in den Organismus bezeichnet man als .,Infec- tion'' desselben. Diese organischen Keime brauchen nicht stets Bakterien zu sein. Wir kennen auch andere, pflanzliche sowohl wie thierische, Mikroorganismen, welche in analoger Weise krankhafte Ver- änderungen des thierischen Körpers veranlassen können. Diejenigen Mikroorganismen, welchen derartige krankheits- erregende Eigenschaften zukommen, bezeichnet man als Para- siten gegenüber denjenigen, die auf todtem organischen Material vegetiren , und die man S a p r o p h y t e n nennt. Die durch die para- sitischen Bakterien hervorgerufenen Krankheiten sind je nach den verschiedenen Bakterienarten verschieden, und jede hierher gehörige Infectionskrankheit hat ihren speci fischen Erreger. Ein jeder dieser Erreger vermag aber nur bei ganz bestimmten (je für die 188 B- Die Bakterien als Krankheitserreger. verschiedenen Bakterienarten verschiedenen) Thierspecies Erkrankung zu veranlassen, während die anderen Thierspecies durch ihn nicht be- einflusst werden: Für jede hierher gehörige Parasitenart existiren be- stimmte „empfängliche" Thierspecies. Auch kann die nach der Einverleibung eines bestimmten Erregers in den Organismus ein- tretende Erkrankung eine verschiedene sein, je nachdem die befallenen Thiere verschiedenen empfänglichen Arten, oder so- gar je nachdem sie verschiedenen Altersstufen einer und der- selben Thierart angehören. Es giebt unter den parasitischen Bakterienarten manche, die be- hufs ihrer Entwickelung des lebenden Organismus als Nähr- bodens durchaus bedürfen, die ausserhalb dieses lebenden Organismus in der Xatur sonst nicht existiren können. Diese nennt man obligate (echte, strenge) Parasiten. Auf der anderen Seite giebt es parasitische Bakterienarten, welche gewöhnlich ein saprophytisches Da- sein führen, draussen in der Natur an geeigneter Stelle die Bedingungen für ihre Existenz finden, und die die Invasion des lebenden Organis- mus nur als gelegentlichen Abstecher betrachten, dessen sie zu ihrer Existenz durchaus nicht bedürfen. Diese Arten nennt man facul- tative (gelegentliche) Parasiten. Zu dem Begriffe des Para- sitismus gehört aber immer, dass die Bakterien nicht bloss auf oder in dem lebenden Organismus vegetiren, sondern dass sie von der Substanz des Organismus selbst ihre Existenz bestreiten, die lebende Substanz also verändern. So sind z. B. die Milliarden von Bakterien, die in dem Inhalte unseres Darmes stets gefunden werden, keine Parasiten , sondern Saprophjten : denn sie ernähren sich nicht von der lebenden Substanz unseres Darmes, sondern von dem todten Materiale, welches innerhalb desselben vorhanden ist. Würde der Fall eintreten, dass die in dem Darmlumen auf dem todten Materiale vege- tirenden Bakterien giftige Stoffwechselproducte bildeten, die, von den Organen der Darmwand aufgesogen, in den Körper überträten und denselben zur Erki-ankung brächten, so würde man ebenfalls nicht von „Parasiten"', von einer „Infection", reden können, sondern man müsste einen derartigen Vorgang als „Intoxication" bezeichnen, A^eranlasst durch die Resorption bestimmter, durch saproph}i:ische Bakterien im Darmkanal gebildeter chemischer Zersetzungsproducte./' Zu einer „In- fectiun" gehört stets, dass die lebende Substanz des Körpers von den Mikroorganismen befallen wird, und dass die letzteren sich auf Kosten der lebenden Substanz vermehren. 31 Wenn wir nun bei einem bestimmten Krankheitsfalle Bakterien, oder ganz im Allgemeinen IVIikroorganismen, im Körper aufgefunden I. Einleitendes. Igg haben, smd Avir dann berechtigt, dieselben als Erreger der Krankheit anzusprechen? Durchaus noch nicht. Zu einem derartigen Urtheile gehört mehr als der blosse Befund, womöglich der Befund in ver- einzelten Fällen der Krankheit. Zunächst ist der Nachweis zu führen, dass in allen Fällen der betreffenden Krankheit, die uns irgend zur Untersuchung zugänglich sind, der Befund wiederkehrt, dass wir es mit einem Consta nten, nicht vereinzelten Befunde zu thun haben. Weiter darf sich dieser Befimd bei keiner anderen Krankheit zeigen, er muss etwas für die untersuchte Krankheit Speci fisch es darstellen. Ist ein constanter speciiischer Bakterienbefund oder überhaupt ein constanter specifischer Befund von Organismen bei einer bestimmten Ivrankheit festgestellt, so ist damit bereits ausserordentlich viel ge- wonnen. Es kann nicht oft genug darauf hingewiesen werden, dass dieser Punkt erst erledigt sein muss, ehe an irgend etwas Weiteres gedacht werden kann. So konnte z. B. der (jetzt verlassene) aus der Luft von Malaria gegenden gezüchtete „Malariabacillus" von vornherein keine Aussicht auf definitive Anerkennung haben, Aveil im Körper des Malariakranken überhaupt niemals ein parasitirender Bacillus gefunden worden ist. Wenn man das Gebäude der Feststellung der Aetiologie einer bestimmten Infectionskrankheit aufrichten will, so darf man, wie uns die logische Art des Vorgehens R. Koch 's eindringlich gelehrt hat, nicht mit dem Dach beginnen, sondern muss mit dem Fundamente den Anfang machen. Das Fundament aber ist der con staute Nachweis der Parasiten im erkrankten Körper, und zwar der mikroskopische Nachweis. Wie man es anfängt, Bakterien mikroskopisch nachzuweisen, haben wir oben (p. 47 ff.) ausführlich erörtert. Es soll hier nur auf Täuschungen, denen man dabei eventuell ausgesetzt sein könnte, hingewiesen werden.^) Man wird sich zunächst hüten müssen, etwaige Färb stoffnieder schlage (cf. oben p. 66), die sich im Präparate finden, für Bakterien zu halten. Die Beschränkung dieser Nieder- schläge auf die Oberfläche des Schnittes, die verschiedene Grösse und Gestalt derselben lässt hier Verwechselungen nicht leicht zu. Ebenso wird man sich hüten, die Kömer der M a s t z e 1 1 e n für Mikrococcen an- zusprechen (cf. p. 96). Hat man wirklich Bakterien vor sich, so könnten dieselben aus den Farblösungen oder sonstigen benutzten Reagentien stammen. Sie könnten dahinein durch irgend welchen Zufall gerathen *) cf. E. Koch, Untersucliimgen über die Aetiologie der AVundinfectionsirank- heiten. Leipzig. ISTS. p. 37. 190 B- Diß Bakterien als Krankheitserreger. sein, sich Gventiiell sogar darin vermehrt haben, um nachher auf dem in der Farblösung etc. behandelten Schnitt (ebenfalls oberflächlich) sich festzusetzen. Hat man diese Täuschungen vennieden, hat man wirklich Bakterien vor sich, die innerhalb des Schnittes hegen, so muss der Einwand ausgeschlossen werden, dass es sich eventuell um Fäulnissbakterien handeln könnte, welche post mortem in das Organ hineingelangt sind. „Jedesmal, wenn einzelne Bakterien nur in den oberflächlichen Schichten von Organen gefunden werden, ist zu vermuthen, dass es sich um beginnende Fäulniss handelt" (Koch^)). Es ergiebt sich hieraus die Regel, die Section zu untersuchender Leichen stets möglichst bald nach dem Tode vorzunehmen und die Organe möglichst sofort in Alcohol einzulegen. Findet man aber die Bakterien im Innern von Organen in Lage- verhältnissen , die nur während des Lebens zu Stande kommen können, „oder ist gar der unverkennbare Einfluss der Mikroorganismen auf das von ihrer Livasion betroffene Gewebe, z. B. Nekrose der in einem gewissen Bereich gelegenen Zellen, Anhäufimg von Rundzellen in der Nachbarschaft, Eindringen der ft-emden Organismen in die Zellen u. s. w. zu constatiren, dann müssen solche Mikroorganismen als pathogen angesehen werden; mindestens müssen sie verdächtig er- scheinen und zur weiteren Untersuchung und Aufklärung des Befundes auffordern" (Koch -)). Eine besondere Berücksichtigung verdienen die Oberflächen der äusseren Haut und der Schleimhäute (namentlich des Darmes), an denen normaler Weise harmlose Bakterien schmarotzen, die nicht für pathogene gehalten werden dürfen. Uebrigens werden Anr uns mit dem Nachweise von „Sporen" im Gewebe nie begnügen dürfen. Es liegt in der Natur der Sache, dass die im thierischen Körper sich vermehrenden Bakterien, hier also im Speciellen die Bacillen, in ihren vegetativen Formen vorhanden sind. Das schliesst nicht aus, dass unter Umständen, speciell bei den anaeroben Bacillenarten, auch sporentragende Stäbchen gefunden werden können. Das isolirte Vorkommen von „Sporen" im Gewebe aber, das übrigens einwandsfi'ei nüki'oskopisch kamii nachzuweisen sein dürfte, ist bisher nicht beobachtet und auch wohl unmöglich ; und ein solcher vermeintlicher Nachweis muss deshalb stets mit der grössten Reserve aufgenonnuen werden und darf jedenfalls nicht als Beweis für das Vorhandensein von Bakterien im Gewebe gelten. 1) Ebenda. -) Mittb. a. d. Kais. Ges.-Amte. Bd. 1. ISSl. I. Einleitendes. 191 Hat man die constante Anwesenheit bestimmter Bakterienformen in allen Fällen einer bestimmten Krankheit sowie ihr Fehlen bei anderen Krankheiten mikroskopisch nachgewiesen, so kann man daran denken, die aufgefundenen Bakterien künstlich zu züchten. Zu diesem Zwecke müssen wir aus den von den Bakterien befallenen Organen Material entnehmen und dies unter möglichster Vermeidung von Verunreinigungen auf künstliche sterile Nährböden bringen. Man säubert dann bei der Section die zu durchschneidende Haut der auf dem Sectionsbrett fixirten Thiere äusserlich durch sorgfältiges Ent- haaren und Abwaschen mit Sublimatlösung unter nachheriger eventueller Kachspülung mit Alcohol und Aether. Die zu benutzenden Messer, Scheren, Pincetten etc. werden in durch Ausglühen sterilisirtem Zu- stande angewendet. Die so in möglichst originalem Zustande ent- nommenen Organe werden mit sterilem Messer durchschnitten; und es werden nun mit sterilem Instrumente Partikelchen aus dem Organ herausgenommen und davon Plattenculturen angelegt, um die in dem Organ vorhandenen Bakterienkeime zu isoliren und ihre Eigen- schaften in sicheren Eeinculturen weiterhin prüfen zu können. Man wird sich hierbei natürlich nicht mit der Nährgelatine begnügen dürfen, sondern wird jedenfalls auch Agarplatten anzulegen haben, um die Züchtung der Colonien bei Brüttemperatur vornehmen zu können. Ausser durch die Plattencultur erreicht man die sichere Isolirung der einzelnen Keime bekanntlich auch durch Oberflächen-Strich- culturen, welche man auf durchsichtigem festem Nährboden anlegt (cf. oben p. 160). Da die verschiedenen Bakterienarten verschiedene Ansprüche stellen, und es speciell manche pathogene Arten giebt, die WTder auf der Gelatine noch auf dem Agar wachsen, so muss man daneben noch andere Nährböden, wie Glycerin - Agar , Traubenzucker- Agar, erstarrtes Blutserum, Blutserum - Agar , Blut -Agar etc. bereit haben, um die Züchtung darauf zu versuchen. Auch darauf wird man im gegebenen Falle Eücksicht zu nehmen haben, dass die zu züchtenden Bakterien den obHgaten Anaeroben angehören könnten. Es ist jedenfalls zunächst immer danach zu streben, eine Iso- lirung der Keime zu erreichen. Denn gar häufig ist es der Fall, dass nicht nur eine einzige Bakterienart, sondern mehrere Arten in dem zu untersuchenden Organe vorhanden sind, von denen der einen die wesentliche Bedeutung zukommt, während die andere nur einer Zufälligkeit ihre Anwesenheit verdankt. Sorgt man nun nicht für eine Isolirung der Keime bei der Anlage der Cultur, sticht man z. B. mit dem in das Material getauchten Platindrahte in feste Gelatine ein, legt „primär eine Stichcultur" an, so wird häufig nur diej.enige Bak- 192 B- l^iß Bakterien als Krankheitserreger. terieuart zur Entwickelung kommen, welche m dem Nährboden die besten Lebensbedmgungen findet, während die andere, vielleicht gerade che wesentliche Art, durch das Wachsthum der ersteren erdrückt wird. Man hegiebt sich so jeder Uebersicht über tue ursprünglich vorhandenen Keime. Bei manchen Krankheiten, bei denen man bestimmte, unzweifelhaft parasitäre Organismen constant findet, ist die künstliche Züchtung der letzteren bisher nicht gelungen. Solche Krankheiten sind z. B. das Eecurrensfieber und die intermittirenden (Malaria-) Fieber. Hier sind wir vorläufig auf den constanten specifischen Befund allein angewiesen. Ist die Reinzüchtung einer bestimmten im Körper gefimdenen Art gelungen, so müssen wir die Cultur zunächst durch eine grössere Eeihe von Generationen hindiu-ch von einem Nährboden auf den an- deren fortpflanzen. Unser schliessUches Ziel ist es nämlich, durch TJebertragung der reingezüchteten Bakterienart auf ein empfäng- liches Versuchsthier ihre Pathogenität sicher zu stellen. Es wäre jedoch, wollten wir von der ersten Culturgeneration die TJeber- tragung auf das Thier bewirken, der Einwand berechtigt, dass wir mit den Bakterien zugleich irgend welche direct aus dem Ausgangsthiere stammenden anderweitigen Dinge auf das neue Thier übertragen hätten, und dass nicht die Bakterien, sondern diese anderen Dinge die even- tuelle Erkrankung des Thieres herbeigeführt haben könnten. TJeber- tragen wir dagegen Material aus einer späteren Culturgene- ration, so ist ein derartiger Einwand natürhch hinfällig. Finden wir nun, dass durch die Uebertragung des aus einer späteren Culturgeneration stammenden Materiales auf ein Versuchs- thier eine Krankheit bei diesem Thiere — nicht in einem Falle, sondern in allen Fällen, in denen wir den Versuch wiederholen — entsteht, die der Ausgangskrankheit gleicht, erheben wir bei diesen Thieren denselben Bakterienbefund wie bei dem Ausgangsthiere, so ist die Kette des Beweises geschlossen, dass die reingezüchteten Bakterien das ätiologische Moment der untersuchten Krankheit darstellen. Handelt es sich um eine Thierkrankheit, so ist das emp- fängliche Versuchsthier ohne Weiteres gegeben; handelt es sich dagegen um eine specifische Krankheit des Menschen, so ge- Kngt es häufig gar nicht ein empfängliches Versuchsthier zu finden.^) ') Der Mangel einer empfänglichen Thierspecies macht sich besonders in solchen Fällen fühlbar, wenn es sich darum handelt, zu entscheiden, ob eine Bak- terienart, die man irgendwo in der Natur, ausserhalb des menschlichen Körpers, ge- funden hat, mit einer bestimmten für den Menschen pathogenen Art identisch ist oder nicht. Wenn z. B. bei Gelegenheit einer Typhusepidemie in dem infections- I. Einleitendes. 193 Es hat sich aber ergeben, „dass in allen den Fällen, in welchen es gelungen ist, bei einer Infectionskrankheit das regelmässige und aus- schliessliche Yorkommen von Bakterien nachzuweisen, letztere sich niemals wie zufällige Schmarotzer, sondern wie die bereits sicher als pathogen erkannten Bakterien verhielten. Wir sind deshalb wohl jetzt schon zu der Behauptung berechtigt, dass, wenn das regelmässige und ausschliessliche Vorkommen des Parasiten nachgewiesen wurde, damit der ursächliche Zusammenhang zwischen Parasit und Krankheit auch vollgültig bewiesen ist" (R. Koch^)). Auf der anderen Seite kommt es auch vor, dass empfängliche Yersuchsthiere existiren, ohne dass eine Züchtung der Erreger auf künstlichen Nährböden bis jetzt möglich gewesen ist ; dies ist bei dem Recurrensfieber der Fall, für welches der Affe empfänglich ist. verdächtigen Brunnenwasser eine bestimmte typhusbacillenäbnlicbe Bakterienart ge- funden ist; welcbe Kriterien giebt es, die die sichere Entscheidung, ob der Typhus- bacillus vorliegt oder nicht, ermöglichen? Wir können ganz im Allgemeinen sagen, dass wir in derartigen Fällen, in denen es sich um für den Menschen speci- fisch pathogene Arten handelt, die, ausserhalb des erkrankten mensch- lichen Körpers oder ausser Zusammenhang mit einem bestimmten entsprechenden Kr ankheits falle aufgefunden, identificirt werden sollen, fast jedesmal auf ein negatives Urtheil angewiesen sind. Wir müssen nämlich in solchen Fällen — bei dem • Mangel einer empfänglichen Thierspecies — uns noth- gedrungen damit begnügen, die Wachsthums- und Lebenserscheinungen der zu be- stimmenden Bakterienart auf den verschiedensten künstlichen Nährböden und unter den verschiedensten sonstigen äusseren Bedingungen zu studiren (am besten unter ständiger Vergleichung mit einer authentischen, d. h. aus dem erkrankten mensch- lichen Körper resp. der Leiche gewonnenen, Cultur der entsprechenden pathogenen Art). Finden wir dann keinerlei Differenzen zwischen den Eigenschaften der zu be- stimmenden Art vmd denen der authentisch festgestellten, so können wir zwar aus- sprechen, dass wir die Identität der beiden Arten für höchst wahrscheinlich halten; aber mit Bestimmtheit können wir die Identität nicht aussprechen. Wir sind im Wesen thchen darauf angewiesen, zu sagen, dass der heutige Stand der Wissenschaft nicht ermöglicht, Unterschiede festzustellen. Ganz ausserordentlich anders liegen die Dinge, wenn die zu prüfenden und zu bestimmenden Bakterien innerhalb des erkrankten menschlichen Kör- pers (z. B. in der frischen Leiche) oder überhaupt in unmittelbarem Zu- sammenhange mit dem Krankheitsfalle (z. B. in fiisch entleerten Fäces des Erkrankten) gefunden werden. Hier haben wir ausser den festzustellenden Cultureigenthümlicbkeiten vor allem das wichtige Kriterium für die Beurtheilung, dass die fragliche Bakterienart sich innerhalb des menschlichen Körpers, und zwar in einem klinisch in bestimmter Weise characterisirten Falle, entwickelt und ver- mehrt hat. Handelt es sich um Befunde in Organen der frischen Leiche, so kommt dazu noch die mikroskopisch feststellbare Localisirung der Bakterien in dem <;)ewebe. Auf diese Weise ist die Diagnosticirung der gefundenen Bakterien häufig «ilnie AVeitiTcs mit Bestimmtheit möglich. ') 10. Internat, medic. Congr. 1890. Verhandl. Bd. 1. p. 40. Günther, Bakteriologie. 4. Auflage. 13 194 ^- Di^ Bakterien als Krankheitserreger. Bezüglich der Weiterübertragung der Culturen pathogener Bak- terien von einem Nährboden zum anderen ist übrigens noch Folgendes zu bemerken: AVir sehen gar nicht selten, dass eine bestimmte Art auf dem künstlichen Nährboden zunächst nur kümmerlich wächst, während sie bei weiteren Uebertragungen allmählich an Wachsthums- energie zunimmt und schliesslich sehr gut auf dem künstlichen Nähr- boden fortkommt. Man bezeichnet dies Vorkommniss als Anpassung an den künstlichen Nährboden. Damit ist nun gewöhnlich eine Ab- nahme der pathogenen Eigenschaften oder auch ein vollständiges Ver- schwinden derselben verbunden. Der Parasit hat sich an das sapro- phytische Dasein gewöhnt. Hierauf hat man bei den anzustellenden Thierversuchen zu achten. Bei einzelneu Arten sieht man auch, dass sie auf dem künstlichen Nährboden bald absterben. Während sapro- phy tische Organismen gewöhnlich Monate lang übertragbar l)leiben, verlieren einzelne pathogene Arten ihre Uebertragbai'keit schon nach wenigen Tagen. Als Prototyp einer Infectionskrankheit, deren Aetiologie nach den vorstehend gezeichneten, von R. Koch geschaffenen Principien ermittelt, und zwar mit unanfechtbarer Sicherheit ermittelt wurde, kann der Milzbrand gelten. Nach denselben Principien haben später Koch sowohl wie auch andere Autoren, die sich seine Methoden zu eigen machten, die Entstehungsursache einer Eeihe weiterer Infectionskrank- heiten klargelegt. Die erste, durch Bakterien veranlasste Infections- krankheit, deren Aetiologie ermittelt wurde, war aber der Milzbrand. Es ist leicht einzusehen, weshalb Koch gerade diese Krankheit zum ersten Objecte seiner Untersuchungen machte. Man Avusste bereits längere Zeit, dass im Milzbrandblute Stäbchen gefunden Averden: diese Stäbchen waren relativ gross, eigneten sich also zur Beobachtung besonders; femer waren, falls es gelang, die Stäbchen künstlich in Reinculturen zu züchten, empfängliche Versuchsthiere sicher vorhanden, da es sich ja um eine Thierkrankheit handelte. Die Sch^vierigkeiten der Forschung waren beim Milzbrande also noch relativ gering: und die streng logische Art des Vorgehens Rob. Koch 's spricht sich bereits darin deutlich aus, dass er sich zunächst relativ leichter zu lösende Aufgaben stellte, um später, mit immer mehr vervollständigter und ausgebauter Methodik, an so schwierige Aufgaben heranzutreten, wie sie sich z. B. in der Erforschung der Ursache der Tuberculose dar- stellten. Nicht bei allen infectiösen Krankheiten hat man bisher die Er- reger zu ermitteln vermocht. Von den acuten Exanthemen (Masern, Scharlach, Fleckt^^phus , Pocken etc.) wissen wir noch gar nichts be- I. Einleitendes. 195 züglich ihrer Entstehungsursache ; auch über die Krankheitserreger der Himdswiith, des Keuchhustens, des Trachoms, des Gelbfiebers, der Einderpest, der Lungenseuche und mancher anderer unzweifelhafter Infectionskrankheiten wissen wir noch gar nichts. Und doch müssen hier parasitäre Organismen existiren, die die Erkrankung veranlassen. Ob diese Parasiten zu den Bakterien gehören, ist allerdings höchst zweifelhaft. Bakterienbefunde sind bei allen diesen Krankheiten er- hoben worden, nicht selten mit dem Ansprüche, dass hiermit der Er- reger gefunden sei. Es handelt sich in allen diesen Fällen um logische Fehler in der Art und Weise, aus Beobachtungen Schlüsse zu ziehen. Nicht die Thatsche allein, dass man in dem und jenem Falle einer Lifectionskrankheit Bakterien findet, berechtigt dazu, dieselben für die Erreger der lü'ankheit anzusehen. Dazu gehören, wie wir gesehen haben, zwingendere Beweisgründe. Die gefundenen Bakterien können rein nebensächliche Befunde darstellen, sie können eventuell der Aus- druck einer zu der ursprünglichen, primären Infection in dem einen oder anderen Krankheitsfalle dazugekommenen „secundären In- fection" sein. Man bezeichnet solche Combinationen auch als „ M i s c h i n f e c t i n e n". ^) Die acuten Exantheme sind exquisit „ c o n t a g i ö s ", d. h. von Fall zu Fall ansteckend und übertragbar. Es mag an dieser Stelle auf den Unterschied zwischen Infectiosität und Contagiosität hingewiesen Averden. Eine jede durch specifische Parasiten hervor- gerufene Krankheit ist „infe